PGRN在結(jié)直腸癌中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是目前常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，尋找有效靶點(diǎn)抑制CRC進(jìn)展仍面臨巨大挑戰(zhàn)。
　　腫瘤進(jìn)展是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用、相互促進(jìn)的過(guò)程，腫瘤血管生成和間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化是腫瘤微環(huán)境中重要的促腫瘤因素。
　　顆粒蛋白前體(Progranulin，PGRN)基因位于人17號(hào)染色體，編碼區(qū)由12個(gè)外顯子(Ⅰ-Ⅻ)構(gòu)成。廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等，在介導(dǎo)創(chuàng)傷愈

2、合、抑制神經(jīng)退行性變及軟骨形成方面發(fā)揮了重要作用。
　　腫瘤壞死因子受體2(tumor necrosis factor receptor2,TNFR2)是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員，分為可溶型(sTNFR2)和膜結(jié)合型(mTNFR2)，在多種腫瘤中高表達(dá)，并參與了腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。
　　研究目的：
　　明確PGRN與CRC患者臨床參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性;檢測(cè)PGRN對(duì)CRC增殖和血管生成的作用;檢測(cè)C

3、RC中PGRN對(duì)間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化的作用;明確PGRN發(fā)揮以上作用的分子機(jī)制;明確TNFR2與CRC患者臨床參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，并進(jìn)一步研究PGRN對(duì)TNFR2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以期為CRC的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　研究方法：
　　1.免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)PGRN在CRC組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析CRC組織中PGRN表達(dá)與患者臨床參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系;RT-PCR、W

4、estern blot、ELISA檢測(cè)PGRN在人CRC細(xì)胞系和人正常腸上皮細(xì)胞系中的表達(dá)。
　　2.用p-GPU6/GFP/Neo/PGRN質(zhì)?；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞SW480、SW1116和HT29,獲得干擾PGRN表達(dá)的CRC細(xì)胞株SW480-PGRN-sh、SW1116-PGRN-sh、HT29-PGRN-sh及對(duì)照細(xì)胞株SW480-NC-sh、SW1116-NC-sh、HT29-NC-sh;用pEZ-M61/GFP/PG

5、RN質(zhì)?；蚩蛰d體轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞SW480、SW1116,獲得過(guò)表達(dá)PGRN的細(xì)胞株SW480-PGRN-vector、SW1116-PGRN-vector及對(duì)照細(xì)胞株SW480-NC-vector、SW1116-NC-vector。RT-PCR、Western blot確定轉(zhuǎn)染效率。
　　3.IHC檢測(cè)增殖指標(biāo)Ki67在CRC組織的表達(dá)，并分析與PGRN的相關(guān)性;上調(diào)/下調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后，RT-PCR、Wester

6、n blot檢測(cè)Ki67、抗凋亡指標(biāo)Bcl-2表達(dá)變化;MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。下調(diào)HT29細(xì)胞PGRN表達(dá)后，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)變化。檢測(cè)PGRN重組蛋白對(duì)SW1116細(xì)胞Ki67表達(dá)的影響。
　　4.IHC檢測(cè)VEGF-A、血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記分子CD34在CRC中的表達(dá)，并分析PGRN與VEGF-A表達(dá)和微血管密度(MVD)的相關(guān)性;上/下調(diào)SW1116細(xì)胞PGRN表達(dá)后，檢測(cè)VEGF-A、成纖維細(xì)胞

7、生長(zhǎng)因子1(FGF1)、VEGF-C表達(dá)的變化;檢測(cè)PGRN重組蛋白對(duì)SW1116細(xì)胞VEGF-A表達(dá)的影響;檢測(cè)SW1116-PGRN-vector細(xì)胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)Ki67、VEGF-A表達(dá)及增殖、遷移、成管能力的影響。
　　5.Western blot檢測(cè)PGRN對(duì)SW1116細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal regulated kinases，ER

8、K)、蛋白激酶B(protein kinase B，PKB or AKT)、P38磷酸化水平的影響，并篩選出PGRN下游通路靶點(diǎn)ERK、AKT;加入ERK或AKT通路阻滯劑后，檢測(cè)PGRN誘導(dǎo)的Ki67、VEGF-A表達(dá)的變化，以明確PGRN是否通過(guò)ERK、AKT通路調(diào)節(jié)Ki67、VEGF-A的表達(dá);加入TNFR2中和抗體，檢測(cè)PGRN誘導(dǎo)的SW1116細(xì)胞中Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT的變化，以明確TNFR2在PGR

9、N對(duì)CRC細(xì)胞Ki67、VEGF-A表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用。加入TNFR2中和抗體，檢測(cè)SW1116-PGRN-vector細(xì)胞條件培養(yǎng)基或PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞Ki67、VEGF-A、p-ERK、p-AKT表達(dá)的變化，以明確TNFR2在PGRN誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞血管形成能力中的作用。
　　6.將CRC細(xì)胞SW480、SW1116與結(jié)腸間質(zhì)成纖維細(xì)胞CCD-18Co同時(shí)均勻鋪種于六孔板中，設(shè)固定時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況，比較

10、貼壁時(shí)間的差異;將SW480或SW1116細(xì)胞與CCD-18Co細(xì)胞共培養(yǎng)，根據(jù)貼壁時(shí)間的差異分離獲得成纖維細(xì)胞，分別命名為CCD-18Co/SW480細(xì)胞或CCD-18Co/SW1116細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)上皮標(biāo)記E-cadherin和成纖維細(xì)胞活化標(biāo)記α-SMA的表達(dá)驗(yàn)證分離后成纖維細(xì)胞的純度。
　　7.IHC染色并分析CRC細(xì)胞中PGRN表達(dá)與間質(zhì)中α-SMA表達(dá)的相關(guān)性;將SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh分別與

11、CCD-18Co細(xì)胞共培養(yǎng)，分離后檢測(cè)CCD-18Co、CCD-18Co/SW480-NC-sh及CCD-18Co/SW480-PGRN-sh細(xì)胞中Ki67、FAP、α-SMA的表達(dá)差異;MTT檢測(cè)增殖能力變化;Transwell小室檢測(cè)遷移能力變化;凝膠收縮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)收縮能力變化。同樣方法檢測(cè)SW1116細(xì)胞中PGRN變化對(duì)共培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中Ki67、FAP、α-SMA表達(dá)的影響。PGRN重組蛋白處理CCD-18Co細(xì)胞，進(jìn)一步觀察P

12、GRN對(duì)成纖維細(xì)胞增殖能力、遷移能力、收縮能力的影響。
　　8.分別與SW480-NC-sh、SW480-PGRN-sh細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測(cè)CCD-18Co、CC D-18CO/SW480-NC-sh、CCD-18CO/SW480-PGRN-sh細(xì)胞中ERK、AKT、P38、JNK磷酸化水平的差異;PGRN重組蛋白處理后，檢測(cè)CCD-18Co細(xì)胞ERK、AKT、P38、JNK磷酸化水平變化，篩選出PGRN下游通路靶點(diǎn)ERK、AKT;

13、加入ERK或AKT通路阻滯劑，檢測(cè)PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的CCD-18Co細(xì)胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)變化，明確PGRN是否通過(guò)ERK、AKT通路調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞Ki67、FAP、α-SMA蛋白表達(dá)變化。加入TNFR2中和抗體后，檢測(cè)PGRN重組蛋白誘導(dǎo)的CC D-18Co細(xì)胞中Ki67、FAP、α-SMA、p-ERK、p-AKT表達(dá)及細(xì)胞增殖、遷移、收縮能力的變化。
　　9.IHC檢測(cè)CRC組織中TNFR2的表達(dá)，分析其

14、與CRC患者臨床參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，并分析與PGRN表達(dá)的相關(guān)性;通過(guò)轉(zhuǎn)染上調(diào)/下調(diào)SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞PGRN的表達(dá)，檢測(cè)TNFR2表達(dá)的變化;用PGRN重組蛋白處理SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞，檢測(cè)TNFR2表達(dá)的變化;上調(diào)PGRN表達(dá)或PGRN重組蛋白處理后，檢測(cè)SW480細(xì)胞、SW1116細(xì)胞p-ERK、p-AKT、p-P38的變化;加入ERK阻滯劑U0126或AKT阻滯劑LY294002后，檢測(cè)SW480細(xì)胞、

15、SW1116細(xì)胞TNFR2表達(dá)的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.PGRN在CRC中高表達(dá)，并與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)
　　2.PGRN促進(jìn)了CRC增殖
　　4.PGRN通過(guò)TNFR2/AKT和ERK通路促進(jìn)了CRC細(xì)胞Ki67、VEGF-A的表達(dá)和HUVEC的血管形成能力
　　5.共培養(yǎng)后成纖維細(xì)胞分離及純度鑒定
　　鏡下觀察發(fā)現(xiàn):CCD-18Co細(xì)胞在30分鐘時(shí)已貼壁，SW480

16、、SW1116細(xì)胞在90分鐘時(shí)才開(kāi)始貼壁，貼壁時(shí)間差異明顯;與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)，分離后得到成纖維細(xì)胞CCD-18Co/SW480并進(jìn)行純度驗(yàn)證:免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上皮標(biāo)記分子E-cadherin在SW480細(xì)胞上染色明顯，而CCD-18Co/SW480細(xì)胞成纖維細(xì)胞活化標(biāo)記分子α-SMA染色明顯，未見(jiàn)E-cadherin顯色;Western blot檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)SW480細(xì)胞E-cadherin表達(dá)明顯，未檢測(cè)到α-SM

17、A表達(dá)，而CCD-18CO/SW480細(xì)胞α-SMA表達(dá)明顯，未檢測(cè)到E-cadherin表達(dá)。
　　6.CRC細(xì)胞來(lái)源的PGRN促進(jìn)了成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、收縮能力
　　7.TNFR2/AKT和ERK信號(hào)通路參與了PGRN對(duì)成纖維細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)
　　8.TNFR2在CRC中高表達(dá)，并與患者年齡、腫瘤大小及不良預(yù)后密切相關(guān)
　　9.PGRN通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)CRC細(xì)胞TNFR2的表達(dá)
　　研究結(jié)論：<