IL-17A在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌變中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，是整個(gè)世界范圍內(nèi)造成死亡的主要疾病之一，在歐美國(guó)家分別位列第一、二位，發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2014年美國(guó)新發(fā)CRC病例136830例，死亡50310例。近年來，我國(guó)結(jié)直腸癌特別是直腸癌(占60％)的發(fā)病率和病死率也呈不斷上升趨勢(shì)，CRC的發(fā)病率在我國(guó)城市和農(nóng)村分別占惡性腫瘤發(fā)病率的第四位和第六位，嚴(yán)重威脅國(guó)民的身心健康。潰瘍性結(jié)腸炎相

2、關(guān)結(jié)直腸癌是潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis, UC）的嚴(yán)重并發(fā)癥，雖然只占所有CRC的1%～2%，但死亡率卻占UC患者的10%～15%。
　　結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素、多階段的過程。研究表明某些因素能夠增加患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，如年齡、結(jié)直腸息肉、潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病、結(jié)直腸癌家族史、種族、2型糖尿病等，家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)或遺傳

3、性非息肉病性大腸癌(hereditary nonpolyposis colon cancer, HNPCC)等家庭綜合癥。一些生活習(xí)慣因素也與高結(jié)腸直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，如膳食中含大量紅肉類（牛肉、羊肉、或肝臟）、加工肉類（如熱狗和博洛尼亞）及高熱量食品，缺乏鍛煉、超重和肥胖、吸煙、酗酒等。眾所周知，炎癥性腸病(Inflammatory bowel diseases, IBD)，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，有發(fā)展成為結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)，目前普遍

4、認(rèn)為，IBD是攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素參與下，由于慢性腸道感染、黏膜抗原屏障缺陷以及腸腔內(nèi)抗原物質(zhì)的異常免疫反應(yīng)所導(dǎo)致。長(zhǎng)期UC患者發(fā)生癌變的危險(xiǎn)性升高，UC并發(fā)結(jié)直腸癌癌變可能與其慢性炎癥長(zhǎng)期作用相關(guān)，其發(fā)生發(fā)展經(jīng)歷著從正常上皮組織、低度異型增生、高度異型增生到癌變的過程，但目前具體機(jī)制仍不明，多方面因素改變均可能在癌變過程中發(fā)揮重要作用。
　　白細(xì)胞介素17(Interleukin-17, IL-17)是體內(nèi)重要的促炎

5、癥細(xì)胞因子，由155～197個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量約為20～30kDa，主要由活化的T淋巴細(xì)胞分泌，包括CD4+CD45RO+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、γδT細(xì)胞等，其中，CD4+T細(xì)胞亞群中Th17細(xì)胞是IL-17的主要來源細(xì)胞，但最近研究發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及某些腫瘤細(xì)胞均可產(chǎn)生 IL-17。IL-17家族以同源或異源二聚體的形式行使功能，IL-17與IL-17RA/IL-17RC異源二聚體形成復(fù)合體，通過類似于纖維母細(xì)胞因子的

6、表達(dá)方式，激活核因子-κB（NF-κB）激活劑1（nuclear factor-κB activator1, Act1)、IL-17受體和 Toll-IL-1R（SEFIR)受體結(jié)構(gòu)域。Act1是一種 E3泛素連接酶，通過Ubc13/Uev1A E2復(fù)合物，以K63多聚泛素化的方式在K124位修飾腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor6, TRAF6)

7、，介導(dǎo)IL-17下游信號(hào)傳遞及炎癥基因表達(dá)。多聚泛素化的TRAF6激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1(transforming growth factor-β- activated kinase1, TAK1)和IκB激酶(IκB kinase, IKK)復(fù)合物，后者激活NF-κB信號(hào)通路，啟動(dòng)包括 CXCL1、IL-6、VEGF等的一系列化學(xué)因子、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄。IL-17只能微弱激活下游信號(hào)及基因表達(dá)，但I(xiàn)L-17可以調(diào)控 mR

8、NA穩(wěn)定性，以此協(xié)同其他細(xì)胞因子，從而放大靶細(xì)胞對(duì)IL-17的反應(yīng)。IL-17能夠通過IKKi激酶依賴的Act1-TRAF2- TRAF5復(fù)合體，增加下游CXCL1mRNA穩(wěn)定性，Act1-TRAF2-TRAF5復(fù)合體與剪接子2(splicing factor2, SF2)綁定，阻止SF2/ASF介導(dǎo)的mRNA降解。目前，IL-17在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在爭(zhēng)議，利用動(dòng)物模型，一些研究發(fā)現(xiàn)IL-17A可以通過IFN-γ生產(chǎn)NK細(xì)胞和T

9、細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而另有研究表明，IL-17A能夠通過IL-6/Stat3信號(hào)途徑或通過誘導(dǎo)腫瘤局部微環(huán)境改變，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
　　本研究旨在探討IL-17A在結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討，為治療結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。
　　第一部分人結(jié)腸組織癌變與IL-17A誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)
　　目的：探討IL-17A誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在人結(jié)腸癌中的作用。
　　方法：通過

10、ELISA方法檢測(cè)結(jié)腸組織中 IL-17A細(xì)胞因子濃度， Western blot方法檢測(cè)IL-17/IL-17R、VEGF、MMP2、MMP7、MMP9、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白，免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè) IL-17、MMP2蛋白在結(jié)腸組織中的定位，利用CD34染色檢測(cè)結(jié)腸組織中微血管密度。
　　結(jié)果：IL-17A和IL-17RA蛋白均為結(jié)直腸癌組織中最高，明顯高于腺瘤、潰瘍性結(jié)腸炎及正常結(jié)腸組織。伴隨 IL-

11、17A和 IL-17RA增加， IL-17A誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，包括細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào) ERK1/2和JNK激活、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9、MMP7和MMP2、Bcl-2和CyclinD1表達(dá)增加，Bax表達(dá)減少。結(jié)直腸癌組織中VEGF和VEGFR表達(dá)最高，其次為腺瘤組織，而在潰瘍性結(jié)腸炎組織和正常結(jié)腸組織中的 VEGF蛋白幾乎檢測(cè)不到。
　　第二部分 IL-17A對(duì)HCT116細(xì)胞遷移侵襲能力的影響
　　目的：探討IL-17

12、A對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)HCT116細(xì)胞，經(jīng)過不同的處理（空白對(duì)照組、IL-17A處理組、PD98059+IL-17A組、SP600125+IL-17A組），分別采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力， Western blot方法檢測(cè)IL-17RA、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、MMP2、MMP7、MMP9、CyclinD1、Bcl-2、Bax、VEGF、VEGFR蛋

13、白表達(dá)。
　　結(jié)果：臺(tái)盼藍(lán)染色及細(xì)胞藍(lán)?檢測(cè)均顯示IL-17A處理的HCT116細(xì)胞增殖活性高于對(duì)照組，而PD98059和SP600125預(yù)處理組細(xì)胞增殖活性顯著下降；對(duì)照組、IL-17A組、PD98059和SP600125預(yù)處理組Transwell穿膜細(xì)胞數(shù)為9.5±1.06、15.4±1.11、3.7±0.53和4.3±0.55，除后2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-17A組HCT116細(xì)胞遷移能

14、力最強(qiáng)，劃痕變窄，而PD98059和SP600125預(yù)處理組細(xì)胞遷移能力下降，劃痕距離未見明顯變化；IL-17A增加HCT116細(xì)胞IL-17RA、MMP2、MMP7、MMP9、CyclinD1、Bcl-2、VEGF、VEGFR蛋白分泌，使ERK1/2、JNK磷酸化增加，給予PD98059和SP600125預(yù)處理，上述蛋白表達(dá)減少。
　　第三部分 IL-17A siRNA對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型小鼠的治療作用
　　目的：探討

15、IL-17A siRNA對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌模型小鼠的治療作用。
　　方法：采用偶氮氧化甲烷/葡聚糖硫酸鈉方法建立潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌小鼠模型，建模成功后給予IL-17A siRNA干擾治療，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組和IL-17A siRNA治療組，Real-time PCR檢測(cè)各組結(jié)腸組織IL-17A、IL-17ramRNA水平，Western blot檢測(cè)IL-17A、IL-17RA、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、

16、MMP2、MMP7、MMP9、CyclinD1、Bcl-2、Bax、VEGF、VEGFR蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：IL-17A siRNA治療組小鼠體重較模型組增加，粘膜上皮損傷及腺體結(jié)構(gòu)的消失程度均較模型組減輕；IL-17A和IL-17RA基因和蛋白均為模型組最高，IL-17A siRNA治療組次之，對(duì)照組最低（P<0.05）；IL-17A siRNA治療組p-ERK1/2、p-JNK蛋白低于模型組；模型組、IL-17A siRNA

17、治療組、對(duì)照組結(jié)腸組織中MMP2、MMP7、MMP9、Bcl-2、Cyclin D1、VEGF、VEGFR蛋白表達(dá)依次降低，而Bax則為對(duì)照組最高，模型組最低。
　　結(jié)論：
　　1結(jié)直腸癌組織中IL-17A表達(dá)增高。
　　2 IL-17A可能通過ERK1/2和JNK1/2信號(hào)通路調(diào)控下游信號(hào)蛋白表達(dá)，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。
　　3 IL-17A siRNA治療能夠抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展，可能成為結(jié)直腸癌預(yù)防和治