EMT相關(guān)microRNA在結(jié)直腸癌中的表達與功能研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計90％的腫瘤患者死于腫瘤的轉(zhuǎn)移，常規(guī)的手術(shù)治療、化療、放療難以對其進行有效逆轉(zhuǎn)，如何有效地早期檢測和靶點治療腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，尋找新的腫瘤標(biāo)志物以便及早診斷和進行個體化治療，是降低癌癥惡性行為的關(guān)鍵，對結(jié)直腸癌防治有重大意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，EMT

2、現(xiàn)象與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在多種癌癥的原位浸潤和遠處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。microRNA(miRNA)是一系列內(nèi)源性非編碼小RNA(通常長度在18-25nt)的總稱。miRNA在基因轉(zhuǎn)錄后起翻譯抑制作用，主要是通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(3'untranslational region,3'UTR)結(jié)合達到抑制蛋白翻譯的生物學(xué)作用。最近發(fā)現(xiàn)miRNA在EMT過程中有重要的表達調(diào)控作用。隨著研究的深入，有關(guān)miRNA與腫瘤E

3、MT之間關(guān)系研究逐漸增多，但目前國內(nèi)外探討EMT相關(guān)miRNA在結(jié)直腸癌中的研究尚屬起步階段。
　　 研究方法和內(nèi)容:
　　 本研究小組的前期研究，采用EGF和TGF-β誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細胞SW480發(fā)生EMT并采用miRNA芯片篩選出誘導(dǎo)過程中不同時間點的差異miRNA分子，通過初步Real-time PCR驗證，從中篩選出了3個差異miRNA分子: Hsa-miR-138、Hsa-miR-139-5p、Hsa-miR-1

4、180，本課題擬從細胞和分子水平證實相關(guān)分子在結(jié)直腸癌細胞EMT過程中的細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)特征，從臨床組織標(biāo)本水平驗證相關(guān)差異miRNA分子的表達，并進一步結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測與靶基因驗證的方法初步闡明相關(guān)miRNA在結(jié)直腸癌細胞EMT過程中的分子調(diào)控機制。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1.EMT相關(guān)miRNA在結(jié)直腸癌細胞及臨床組織標(biāo)本中的表達:(1) Real-time PCR連續(xù)多時間點驗證miR-138、miR-1

5、39-5p、miR-1180的在結(jié)腸癌細胞EMT過程中的表達。驗證結(jié)果與芯片相符。(2)Real-time PCR檢測24對癌組織及其配對正常粘膜組織中miR-138的表達。結(jié)果顯示在22對樣本中，miR-138在癌組織中的表達相較其配對正常粘膜明顯下調(diào)，僅2例癌組織中miR-138表達升高，具有顯著性差異，配對正常粘膜組/腫瘤組比值=2.66; miR-139-5p在18例配對標(biāo)本中檢測，結(jié)果顯示兩組間表達無顯著性差異。(3) miR

6、-138在結(jié)直腸癌、癌遠端正常粘膜和淋巴結(jié)中的原位雜交結(jié)果顯示:miR-138在結(jié)直腸癌組織中表達明顯低于配對癌旁組織與癌遠端正常粘膜，有顯著性差異;癌遠端正常粘膜與癌遠端正常粘膜相比無統(tǒng)計學(xué)差異;結(jié)直腸癌原發(fā)灶表達陽性率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌，兩者相比有統(tǒng)計學(xué)差異。(4) CRC臨床病理特征的相關(guān)性分析:組織芯片原位雜交結(jié)果表明，miR-138陽性表達與性別、分化程度以及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、Dukes分期、遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)。

7、　　 2.mir-138、mir-139-5p在結(jié)腸癌細胞中的生物學(xué)功能:Transwell侵襲實驗表明miR-138可以減弱SW480細胞的遷移侵襲能力，miR-139-5p可以增強SW480細胞的遷移侵襲能力，流式細胞學(xué)結(jié)果表明miR-138能明顯促進細胞凋亡，減慢細胞周期進程，miR-139-5p對細胞周期及凋亡影響不明顯，MTT及劃痕試驗表明miR-138可抑制HT-29細胞的生長及增殖，并可明顯抑制SW480細胞的運動遷移能

8、力。
　　 3.miR-138、miR-139-5p調(diào)控的靶基因預(yù)測及鑒定:(1)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果提示miR-138的靶基因參與TGF-β、Pathway incancer等通路;miR-139-5p的靶基因參與Pathway in cancer、Colorectalcancer pathway等通路。結(jié)合預(yù)測數(shù)據(jù)進一步選擇CDH1、VIM、CD44、EZR、ZEB2、CTNNA1/2、FN1、MMP2等基因進行驗證。(2

9、) Real-timePCR檢測SW480細胞轉(zhuǎn)染miR-138、miR-139-5p過表達和抑制表達載體后target gene的表達以及TGF-β處理SW480細胞48h使其發(fā)生EMT，分別瞬時轉(zhuǎn)染miR-138、miR-139-5p過表達載體和抑制表達載體后，Real-time PCR檢測預(yù)測的target gene表達，結(jié)果初步提示miR-138target gene為EZR,miR-139-5p target gene為CDH

10、1、ZEB2。(3)熒光素酶實驗:構(gòu)建了含EZRIN與miR-138結(jié)合位點及其缺失突變型的PMIR載體，含CDH1、ZEB2與miR-139-5p結(jié)合位點及其缺失突變型的PMIR載體，采用熒光素酶報告系統(tǒng)，結(jié)果提示:EZRIN是miR-138調(diào)控的靶基因，CDH1是miR-139-5p下游調(diào)控的靶基因。(4)Western-blot證實轉(zhuǎn)染miR-138及miR-139-5p前后EZRIN、CDH1蛋白表達下調(diào)，表明:EZRIN受mi

11、R-138的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，CDH1受miR-139-5p的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-138在結(jié)直腸癌組織和TGF-β誘導(dǎo)發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化的結(jié)腸癌細胞SW480中均表達下調(diào)。
　　 2.miR-138可抑制HT-29細胞的生長及增殖，抑制SW480細胞的遷移和侵襲，并可明顯促進細胞凋亡，阻滯G1期細胞生長;miR-138可通過作用于靶基因EZRIN而發(fā)揮其抑制結(jié)腸癌EMT轉(zhuǎn)化的功能。