結直腸癌中miRNAs表達譜的研究.pdf

1、結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的消化道惡性腫瘤。其發(fā)病與高脂肪和缺少膳食纖維的不良飲食結構有關。隨著我國人民群眾生活水平的大幅提高和生活方式的西化，CRC的發(fā)病率逐年提高。近年，CRC在我國發(fā)病率已經上升到第5位，死亡率也居第5位。根據世界其他國家CRC發(fā)生發(fā)展的變化規(guī)律，結合我國各地區(qū)近年來癌癥發(fā)病率動態(tài)，CRC將成為本世紀我國發(fā)病率上升速度最快的惡性腫瘤之一。
　　microRNA屬于內源性非

2、蛋白質編碼小RNA（small non-protein-coding RNA）。miRNA最早是在分析線蟲遺傳學信息時發(fā)現(xiàn)[1-2]，并命名為lin-14。在細胞的生長、組織分化、各種疾病的發(fā)生、甚至在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中miRNA都發(fā)揮著極為重要的作用。
　　研究證實miRNA異常表達在多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均以癌基因或抑癌基因的角色起到重要的調控作用。從各種miRNA數(shù)據庫的資料中可以看出每個miRNA可調控幾十甚至數(shù)百個靶基因，

3、而同一個基因的表達也可以同時受多個miRNA干擾。這使得為數(shù)眾多的miRNA與其靶基因之間形成復雜的網絡系統(tǒng)。眾多的研究表明miRNA-31在不同的腫瘤內有著不同的表達，在某些組織其表達顯著升高如：大腸癌，頭頸部鱗癌，肝細胞癌，口腔鱗癌，肺癌；但在其他一些組織卻出現(xiàn)了表達下調如：膀胱癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌，漿液性卵巢癌等。miR-31的表達高低與腫瘤的侵襲及浸潤也有相關性，如在乳腺癌miR-31的高表達導致侵襲性降低，而在結直腸癌其

4、表達升高與侵襲性呈正相關。Ezrin蛋白是細胞膜與細胞骨架之間的連接蛋白，與腫瘤的侵襲性密切相關，是 ERM蛋白（Ezrin、Radixm、Moesin）家族的一員，以往又稱為eytovillin、P81或villin-2。
　　miRNA的研究尚處于起步階段，miRNA的表達與結腸癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤和轉移之間到底存在著什么樣的具體關系，目前還不是十分明了。本研究擬采用miRNA芯片及 RT-PCR，免疫組織化學等研究方法，旨在

5、通過對比研究結直腸癌及其癌旁正常組織中microRNAs（miRNAs）的差異表達，初步探討結直腸癌組織中miRNA的差異表達譜及其在結直腸癌臨床生物學特點判定中的檢測意義。
　　本文收集手術切除的11例新鮮的結直腸癌和其癌旁正常組織標本，立即低溫保存并提取RNA。應用AFFX miRNA表達譜芯片實驗初步篩查癌及癌旁正常組織中miRNAs的差異表達，并采用實時定量PCR技術驗證芯片檢測結果。結果表明結直腸癌和癌旁正常組織中 mi

6、RNAs表達有明顯差異，與癌旁正常組織相比，結直腸癌中有25個miRNAs表達顯著不同（P<0.001），包括15個上調和10個下調的miRNAs。高表達的miRNAs分別是：hsa-miR-31，hsa-miR-767-5p，hsa-miR-105，hsa-miR-196b，hsa-miR-224，hsa-miR-483-5，hsa-miR-1246，hsa-miR-196b，hsa-miR-663b，hsa-miR-584，hsa-

7、miR-141，hsa-miR-18a，hsa-miR-19a，hsa-miR-452，hsa-miR-622。低表達的miRNAs分別是：hsa-miR-215，hsa-miR-4298，hsa-miR-139-5p，hsa-miR-490-5p，hsa-miR-3201，hsa-miR-363，hsa-miR-187，hsa-miR-133a，hsa-miR-1825，hsa-miR-30a。進一步的qRT-PCR結果顯示：與癌旁正

8、常組織相比，癌組織中 miR-31，miR-105，miR-196b，miR-224，miR-483-5p和miR-767-5p的mRNA表達水平明顯上調（P<0.05），而miR-139-5p，miR-215，miR-490-5p和miR-4298等mRNA水平明顯下調（P<0.05），與芯片結果一致。
　　在此基礎上，選取結直腸癌中顯著高表達的miR-31，miR-105和miR-196b作為進一步深入研究的對象，并進一步擴大

9、了病例數(shù)，以53例新鮮的結直腸癌及其15例癌旁正常組織作為研究對象，應用qRT-PCR技術對比分析其異常表達與臨床生物學特點之間的相關性。同時，通過Targets Scan檢索，分析miR-31的密切相關基因—Ezrin，并應用免疫組化及RT-PCR方法確定其在CRC組織中的過表達意義。結合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)：miR-31與結直腸癌的病理分型（P<0.01）和臨床分期（P<0.05）顯著相關，但與淋巴轉移及遠處轉移不相關（P>0.05）；

10、miR-105與病理分型，臨床分期，淋巴結轉移及遠處轉移均呈正相關（P<0.05）；而miR-196b只與病理分型有關（P<0.05），但與淋巴結轉移和遠處轉移及臨床分期均無關（P>0.05）。另外，實驗發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白和其mRNA均在CRC組織中存在高表達，且與結直腸癌淋巴結轉移關系密切。
　　結論：結直腸癌中存在著明顯的miRNAs差異表達，miRNAs特異表達可能成為結直腸癌的潛在的診斷和治療的分子靶點。miR-31，mi