結(jié)直腸癌中miRNAs表達(dá)譜的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的消化道惡性腫瘤。其發(fā)病與高脂肪和缺少膳食纖維的不良飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)。隨著我國人民群眾生活水平的大幅提高和生活方式的西化，CRC的發(fā)病率逐年提高。近年，CRC在我國發(fā)病率已經(jīng)上升到第5位，死亡率也居第5位。根據(jù)世界其他國家CRC發(fā)生發(fā)展的變化規(guī)律，結(jié)合我國各地區(qū)近年來癌癥發(fā)病率動態(tài)，CRC將成為本世紀(jì)我國發(fā)病率上升速度最快的惡性腫瘤之一。
　　microRNA屬于內(nèi)源性非

2、蛋白質(zhì)編碼小RNA（small non-protein-coding RNA）。miRNA最早是在分析線蟲遺傳學(xué)信息時發(fā)現(xiàn)[1-2]，并命名為lin-14。在細(xì)胞的生長、組織分化、各種疾病的發(fā)生、甚至在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中miRNA都發(fā)揮著極為重要的作用。
　　研究證實(shí)miRNA異常表達(dá)在多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中均以癌基因或抑癌基因的角色起到重要的調(diào)控作用。從各種miRNA數(shù)據(jù)庫的資料中可以看出每個miRNA可調(diào)控幾十甚至數(shù)百個靶基因，

3、而同一個基因的表達(dá)也可以同時受多個miRNA干擾。這使得為數(shù)眾多的miRNA與其靶基因之間形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。眾多的研究表明miRNA-31在不同的腫瘤內(nèi)有著不同的表達(dá)，在某些組織其表達(dá)顯著升高如：大腸癌，頭頸部鱗癌，肝細(xì)胞癌，口腔鱗癌，肺癌；但在其他一些組織卻出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)如：膀胱癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌，漿液性卵巢癌等。miR-31的表達(dá)高低與腫瘤的侵襲及浸潤也有相關(guān)性，如在乳腺癌miR-31的高表達(dá)導(dǎo)致侵襲性降低，而在結(jié)直腸癌其

4、表達(dá)升高與侵襲性呈正相關(guān)。Ezrin蛋白是細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架之間的連接蛋白，與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，是 ERM蛋白（Ezrin、Radixm、Moesin）家族的一員，以往又稱為eytovillin、P81或villin-2。
　　miRNA的研究尚處于起步階段，miRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤和轉(zhuǎn)移之間到底存在著什么樣的具體關(guān)系，目前還不是十分明了。本研究擬采用miRNA芯片及 RT-PCR，免疫組織化學(xué)等研究方法，旨在

5、通過對比研究結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織中microRNAs（miRNAs）的差異表達(dá)，初步探討結(jié)直腸癌組織中miRNA的差異表達(dá)譜及其在結(jié)直腸癌臨床生物學(xué)特點(diǎn)判定中的檢測意義。
　　本文收集手術(shù)切除的11例新鮮的結(jié)直腸癌和其癌旁正常組織標(biāo)本，立即低溫保存并提取RNA。應(yīng)用AFFX miRNA表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)初步篩查癌及癌旁正常組織中miRNAs的差異表達(dá)，并采用實(shí)時定量PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片檢測結(jié)果。結(jié)果表明結(jié)直腸癌和癌旁正常組織中 mi

6、RNAs表達(dá)有明顯差異，與癌旁正常組織相比，結(jié)直腸癌中有25個miRNAs表達(dá)顯著不同（P<0.001），包括15個上調(diào)和10個下調(diào)的miRNAs。高表達(dá)的miRNAs分別是：hsa-miR-31，hsa-miR-767-5p，hsa-miR-105，hsa-miR-196b，hsa-miR-224，hsa-miR-483-5，hsa-miR-1246，hsa-miR-196b，hsa-miR-663b，hsa-miR-584，hsa-

7、miR-141，hsa-miR-18a，hsa-miR-19a，hsa-miR-452，hsa-miR-622。低表達(dá)的miRNAs分別是：hsa-miR-215，hsa-miR-4298，hsa-miR-139-5p，hsa-miR-490-5p，hsa-miR-3201，hsa-miR-363，hsa-miR-187，hsa-miR-133a，hsa-miR-1825，hsa-miR-30a。進(jìn)一步的qRT-PCR結(jié)果顯示：與癌旁正

8、常組織相比，癌組織中 miR-31，miR-105，miR-196b，miR-224，miR-483-5p和miR-767-5p的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05），而miR-139-5p，miR-215，miR-490-5p和miR-4298等mRNA水平明顯下調(diào)（P<0.05），與芯片結(jié)果一致。
　　在此基礎(chǔ)上，選取結(jié)直腸癌中顯著高表達(dá)的miR-31，miR-105和miR-196b作為進(jìn)一步深入研究的對象，并進(jìn)一步擴(kuò)大

9、了病例數(shù)，以53例新鮮的結(jié)直腸癌及其15例癌旁正常組織作為研究對象，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對比分析其異常表達(dá)與臨床生物學(xué)特點(diǎn)之間的相關(guān)性。同時，通過Targets Scan檢索，分析miR-31的密切相關(guān)基因—Ezrin，并應(yīng)用免疫組化及RT-PCR方法確定其在CRC組織中的過表達(dá)意義。結(jié)合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)：miR-31與結(jié)直腸癌的病理分型（P<0.01）和臨床分期（P<0.05）顯著相關(guān)，但與淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不相關(guān)（P>0.05）；

10、miR-105與病理分型，臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)（P<0.05）；而miR-196b只與病理分型有關(guān)（P<0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期均無關(guān)（P>0.05）。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白和其mRNA均在CRC組織中存在高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。
　　結(jié)論：結(jié)直腸癌中存在著明顯的miRNAs差異表達(dá)，miRNAs特異表達(dá)可能成為結(jié)直腸癌的潛在的診斷和治療的分子靶點(diǎn)。miR-31，mi