microRNA-133b在結(jié)直腸癌中的表達及功能研究.pdf

1、本文擬展開miR-133b在結(jié)直腸癌中的實驗研究，由“miR-133b在結(jié)直腸癌中的表達水平發(fā)生了顯著下調(diào)”這一現(xiàn)象，我們提出miR-133b在結(jié)直腸癌中是否作為一種腫瘤抑制因子而存在？是否是一種潛在的腫瘤治療靶點？由此，我們設計實驗研究如下：
　　 1.研究miR-133b在不同惡性程度的人結(jié)直腸癌細胞系及正常結(jié)腸細胞中的表達特點，探討其表達水平與腫瘤細胞分化水平及轉(zhuǎn)移能力的關系。
　　 2.構(gòu)建miR-133b的真核

2、表達載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染低表達miR-133b的人結(jié)直腸癌細胞，篩選并建立高表達miR-133b的結(jié)直腸癌細胞系。
　　 3.研究高表達miR-133b對人結(jié)直腸癌細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響，并對miR-133b可能的靶基因進行初步預測。
　　 4.建立結(jié)直腸癌裸鼠皮下種植瘤模型，研究miR-133b對荷瘤裸鼠種植瘤的生長抑制作用，動物體內(nèi)實驗進一步證實miR-133b對結(jié)直腸癌生物學行為的影響。
　　

3、第一章 miR-133b在結(jié)直腸癌細胞中的表達及意義
　　 目的：
　　 研究miR-133b在不同惡性程度的結(jié)直腸癌細胞及正常結(jié)腸細胞中的表達特點。
　　 方法：
　　 抽提細胞總RNA，采用實時定量PCR檢測miR-133b在人正常結(jié)腸細胞系及四種不同惡性程度的結(jié)直腸細胞系中的表達，并分析其表達特點。
　　 結(jié)果：
　　 正常結(jié)腸細胞系CCD-18Co中miR-133b的表達顯著高于四

4、種結(jié)直腸癌細胞，且隨著癌細胞惡性程度的增加，miR-133b的表達漸次降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-133b在結(jié)直腸癌細胞中的表達顯著降低，并且隨著細胞惡性程度的增高而降低。
　　 2.SW-620細胞中miR-133b表達量最低，選擇SW-620細胞進行后繼實驗。
　　 第二章 miR-133b真核表達載體的構(gòu)建并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞
　　 目的：
　　 構(gòu)建miR-133b

5、真核表達載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞系SW-620。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)人miR-133b前體序列設計并合成雙鏈核苷酸Pre-miR-133b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGenesi1-1-miR-133b，并對質(zhì)粒測序。
　　 2.將質(zhì)粒pGenesi1-1-miR-133b及對照質(zhì)粒pGenesi1-1-HK轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞SW-620，在濃度為800μg/mL的G418培養(yǎng)液中篩選出穩(wěn)定高表達miR-133

6、b及對照序列的細胞系SW-620-133b和SW-620-HK。
　　 3.實時定量PCR檢測SW-620、SW-620-HK及SW-620-133b中miR-133b的表達，證明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功。
　　 結(jié)果：
　　 1.構(gòu)建miR-133b真核表達載體pGenesi1-1-miR-133b，測序結(jié)果正確。
　　 2.將pGenesi1-1-miR-133b及對照質(zhì)粒pGenesi1-1-HK轉(zhuǎn)染SW-62

7、0細胞后，經(jīng)濃度為800μg/mL的G418-RPMI-1640培養(yǎng)基篩選4周后得到穩(wěn)定表達miR-133b的細胞系SW-620-133b及穩(wěn)定表達對照序列的細胞系SW-620-HK。
　　 3.實時定量PCR檢測miR-133b在各組細胞中的表達，SW-620及SW-620-HK中未檢測出miR-133b，SW-620-133b中miR-133b的表達顯著升高，是LoVo細胞中miR-133b表達的39.4倍。
　　

8、結(jié)論：
　　 成功構(gòu)建miR-133b的真核表達載體，轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細胞SW-620并篩選得到穩(wěn)定高表達miR-133b及對照序列的細胞系SW-620-133b和SW-620-HK。
　　 第三章 miR-133b對結(jié)直腸癌細胞SW-620生物學行為的影響
　　 目的：
　　 研究高表達miR-133b對結(jié)直腸癌細胞SW-620增殖、凋亡、遷移及侵襲等生物行為的影響，并對miR-133b可能的作用靶點進行

9、預測。
　　 方法：
　　 1.實驗分為三組：SW-620細胞組、SW-620-HK細胞組、SW-620-133b細胞組。
　　 2.MTT實驗繪制各組細胞增殖曲線，平板克隆形成實驗比較各組細胞克隆形成能力，綜合評價miR-133b對SW-620細胞增殖能力的影響。
　　 3.Annexin V-PI流式細胞學檢測各組細胞的細胞凋亡情況，評價miR-133b對SW-620細胞凋亡的影響。
　　 4

10、.細胞劃痕實驗檢測各組細胞的細胞遷移能力，評價miR-133b對SW-620細胞的遷移能力的影響。
　　 5.Transwell侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力，評價miR-133b對SW-620細胞侵襲能力的影響。
　　 6.通過microRNA靶點預測網(wǎng)站預測miR-133b可能的作用靶點，并用RT-PCR及Western blot進行初步驗證。
　　 結(jié)果：
　　 1.MTT法繪制細胞生長曲線，SW-6

11、20組與SW-620-HK組間生長曲線差異無顯著性：SW-620-133b與SW-620及SW-620-HK組間增殖曲線有明顯差異，SW-620-133b組細胞增殖顯著低于SW-620組及SW-620-HK組。
　　 2.平板克隆形成實驗，SW-620組平均克隆形成數(shù)為396.6±43.1、SW-620-HK組平均克隆形成數(shù)為385.4±40.8，顯著高于SW-620-133b組的平均克隆形成數(shù)106.9±13.6；SW-620

12、組與SW-620-HK組間差異無顯著性。
　　 3.Annexin V-PI流式細胞結(jié)果示，組間差異具有顯著性；對照組SW-620-HK及空白組SW-620間的細胞凋亡無顯著性差異。
　　 4.細胞劃痕實驗：兩組間差異無顯著性。而高表達miR-133b的SW-620-133b組細胞平均向劃痕區(qū)遷移率顯著低于SW-620組和SW-620-HK組。
　　 5.Tanswell侵襲實驗中SW-620-133b組侵襲細胞

13、數(shù)顯著低于SW-620組及SW-620-HK組，SW-620組及SW-620-HK組間侵襲細胞數(shù)無顯著差異。
　　 6.經(jīng)microRNA靶點預測軟件預測，MET和MMP9可能是miR-133b的靶基因；Westernblot結(jié)果示：MET和MMP9mRNA表達水平在三組細胞中無明顯改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外細胞實驗中，外源性高表達miR-133b可有效抑制結(jié)直腸癌細胞SW-620增殖，促進細胞凋亡；并

14、對細胞遷移及侵襲能力有顯著的抑制作用。
　　 2.MET及MMP9可能是miR-133b作用的靶基因，miR-133b可能在轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平抑制MET和MMP9的表達。
　　 第四章 miR-133b對SW-620細胞生物學行為影響的裸鼠體內(nèi)研究
　　 目的：
　　 探討miR-133b對人結(jié)直腸癌裸鼠皮下種植瘤生長的抑制作用，體內(nèi)實驗進一步驗證miR-133b是一種新的抑癌基因。
　　 方法：<

15、br>　　 1.實驗分組：30只裸鼠隨機分為3組。分別為接種SW-620細胞組、接種SW-620-HK細胞組、接種SW-620-133b細胞組。
　　 2.建立人結(jié)直腸癌裸鼠皮下種植瘤模型，計算成瘤率。
　　 3.致瘤成功后每5天測量裸鼠皮下種植瘤的體積，繪制腫瘤增長曲線。
　　 4.30天后處死裸鼠，獲取腫瘤，記錄并比較各組瘤重。
　　 5.TUNEL法檢測各組種植瘤腫瘤細胞的凋亡情況。
　　

16、 6.免疫組化檢測MET及MMP9在各組種植瘤中的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組裸鼠皮下接種腫瘤細胞5天后均成功致瘤，成瘤率100％。
　　 2.繪制各組種植瘤生長曲線，各組種植瘤持續(xù)生長，未出現(xiàn)致瘤裸鼠死亡，SW-620-133b組種植瘤生長速度顯著低于SW-620與SW-620-HK組(P＜0.05)；終點時間第30天時，SW-620組裸鼠皮下種植瘤的體積為(3.56±0.79)cm3，SW-620

17、-HK組為(3.24±0.68)cm3，顯著大于SW-620-133b組腫瘤體積(0.85±0.14)cm3(P＜0.05)；SW-620-133b組種植瘤平均質(zhì)量為(0.92±0.16)g，明顯低于SW-620組(4.12±0.64)g及SW-620-HK組(3.95±0.61)g。
　　 3.TUNEL法檢測各組種植瘤腫瘤細胞的凋亡情況，高表達miR-133b的細胞SW-620-133b組AI值為(30.28±3.47)％，

18、顯著高于對照組SW-620-HK(7.26±0.84)％及空白組SW-620(7.96±0.92)％(P＜0.05)；SW-620-HK組與SW-620組間AI值無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 4.免疫組化結(jié)果證實MET和MMP9蛋白在SW-620-133b組種植瘤中的表達明顯下調(diào)，與SW-620及SW-620-HK組有顯著差別(P＜0.05)，結(jié)果與體外細胞試驗相符合。
　　 結(jié)論：
　　 1.外源性高表