miR-106a在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其生物功能研究.pdf

1、第一部分：miR-106a在人結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的研究
　　目的：通過實時定量熒光PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測miR-106a在結(jié)直腸癌癌組織、及癌旁正常粘膜中的表達(dá)水平，并分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系。探討miR-106a對結(jié)直腸癌的診斷價值。
　　方法：
　　1、收集2013年10月至2014年3月于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者42例，所有病例術(shù)前未接受任何形式的放化療干預(yù)，

2、臨床病例資料完整。所有病理均由兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進(jìn)行診斷。在術(shù)中留取新鮮腫瘤組織，以及距離腫瘤邊緣至少5cm的癌旁正常粘膜組織標(biāo)本。
　　2、利用Trizol提取組織中總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后通過實時定量熒光PCR反應(yīng)測定miR-106a的表達(dá)水平。
　　3、采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組之間比較使用Mann Whitney檢驗，其中P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以P50

3、(P25, P75)表示，正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　結(jié)果：
　　1、在42例結(jié)直腸癌組織中的miR-106a表達(dá)量明顯高于癌旁組織[26.2882(14.5358,49.3492) vs.8.7187(5.4891,13.6726)]，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0001）。
　　2、 miR-106a的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌組織的病理學(xué)類型密切相關(guān)，腺癌組織的表達(dá)量要高于粘液樣癌組織（100.96±262.

4、20 vs.18.14±18.22, P=0.0348）；浸潤深度為T1、T2的癌組織表達(dá)量要高于浸潤深度為T3、T4的癌組織（271.91±525.60 vs.47.24±74.53, P=0.0431）；中高分化程度的癌組織表達(dá)量要高于低分化的癌組織（108.87±272.79 vs.18.12±19.20, P=0.0343）。而與患者的年齡、性別、分期、腫瘤位置、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等無關(guān)。
　　結(jié)論：miR-10

5、6a在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并且與結(jié)直腸癌組織的病理學(xué)類型、浸潤深度及分化程度有關(guān)，有潛力作為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。
　　第二部分：miR-106a在人結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)的研究
　　目的：血漿miRNA作為一種非侵入性的腫瘤診斷和預(yù)后評價的標(biāo)志物顯示出良好的應(yīng)用前景。研究miR-106a在人結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)量，并分析其在術(shù)前與術(shù)后的差異，同時分析其與臨床病理資料的關(guān)系。了解血漿miR-106a對人結(jié)

6、直腸癌的診斷價值。
　　方法：
　　1、收集2013年10月至2014年3月于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院普外科行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者40例，所有病例術(shù)前未接受任何形式的放化療干預(yù)，臨床病例資料完整。所有病理均由兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進(jìn)行診斷。收集其術(shù)前與術(shù)后7天的外周血。同時收集同期于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院健康體檢人群的外周血42例，年齡性別與試驗組匹配，且無腫瘤病史。
　　2、利用miRNeasy Serum/Plasma

7、Kit提取血漿中總RNA，再通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，最后通過實時定量熒光PCR反應(yīng)測定miR-106a的表達(dá)水平。
　　3采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組之間比較使用Mann Whitney檢驗，其中P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以P50(P25, P75)表示,正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用ROC曲線評價血漿miR-106a表達(dá)量在人結(jié)直腸癌中的診斷價值。
　　結(jié)果：
　　1、

8、本組結(jié)直腸癌患者血漿中miR-106a表達(dá)量比同期健康體檢人群血漿中miR-106a表達(dá)量高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0041）。
　　2、術(shù)后7天病人血漿中miR-106a表達(dá)量比術(shù)前要低(0.16±0.18 vs.8.80±40.50)，但是并沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.16）。
　　3、 ROC曲線下面積為0.858(95％Cl:0.772-0.944)，區(qū)別結(jié)直腸癌患者和健康人的敏感性為73.8%，特異性為87.1%

9、。ROC曲線分析顯示血漿中miR-106a表達(dá)量對區(qū)分結(jié)直腸癌患者與健康人有一定診斷價值。
　　4、結(jié)直腸癌患者血漿中miR-106a的表達(dá)量與年齡、性別、分期、病理類型、位置、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度均無關(guān)（P>0.05）。
　　結(jié)論：結(jié)直腸癌患者血漿中miR-106a表達(dá)量較健康人群明顯上調(diào)，血漿miR-106a用于早期診斷結(jié)直腸癌具有一定意義。但血漿中miR-106a表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料無明顯

10、相關(guān)性。miR-106a有潛力成為結(jié)直腸癌的生物標(biāo)記物。
　　第三部分：miR-106a在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中功能的研究
　　目的：研究miR-106a對結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116生物學(xué)行為的影響，初步探討miR-106a在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、利用lipofectamine2000將miR-106a mimic、mimic control、miR-106a inhibitor、i

11、nhibitor control分別轉(zhuǎn)染入HCT116細(xì)胞內(nèi)，48h后分別測定miR-106a的表達(dá)量。
　　2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染后應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖，分別測定1d、2d、3d、4d、5d的OD值，繪制細(xì)胞生長曲線，比較miR-106a對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響。
　　3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染后采用Annexin V-FITC試劑盒，利用流式細(xì)胞術(shù)研究miR-106a對結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1、轉(zhuǎn)染m

12、iR-106a mimic與轉(zhuǎn)染miR-106a mimic control相比HCT116細(xì)胞中miR-106a的表達(dá)量上升，轉(zhuǎn)染106a inhibitor與轉(zhuǎn)染miR-106a inhibitor control相比HCT116細(xì)胞中miR-106a的表達(dá)量下降。其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、轉(zhuǎn)染miR-106a mimic與轉(zhuǎn)染miR-106a mimic control相比HCT116細(xì)胞增殖明顯增加，

13、轉(zhuǎn)染miR-106a inhibitor與轉(zhuǎn)染miR-106a inhibitor control相比 HCT116細(xì)胞增殖明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、轉(zhuǎn)染miR-106a mimic與轉(zhuǎn)染miR-106a mimic control相比HCT116細(xì)胞早期凋亡明顯減少，其早期凋亡率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（miR-106a mimic vs. mimic control，8.68%±0.75%vs.12

14、.45%±1.16%， n=4）；轉(zhuǎn)染miR-106a inhibitor與轉(zhuǎn)染miR-106a inhibitor control相比HCT116細(xì)胞早期凋亡明顯增加，其早期凋亡率以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（miR-106a inhibitor vs. inhibitor control，8.803%±0.27%vs.6.733%±0.60%，n=4），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　上調(diào)miR-106a的表