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文檔簡(jiǎn)介
1、背景與目的
結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來隨著人民生活水平提高和社會(huì)結(jié)構(gòu)老齡化傾向,其發(fā)病率有增高趨勢(shì)。結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致患者死亡的主要因?yàn)?。多年來為了探討其發(fā)病機(jī)制、早期診斷和有效的治療方法,人們進(jìn)行了大量的研究,取得了一定的進(jìn)展。但其發(fā)病因?yàn)樯形赐耆宄?br> 研究發(fā)現(xiàn)CD137L可組成性表達(dá)于Raji、Daudi、Colo 205、H
2、CT 116、HT29、LX 1、PC 3、SKBR細(xì)胞及人體腫瘤組織細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞株表面的CD137L具有一定的生物學(xué)功能,應(yīng)用固定化的CD137活化CD137L,能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌IL-8。HCT 116、HT 29與T細(xì)胞在加入CD3單抗的培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)時(shí),能顯著促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ,并且IFN-γ的分泌量與腫瘤細(xì)胞的數(shù)量及細(xì)胞表面CD137L的表達(dá)水平呈正相關(guān)。人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株CEM及人B細(xì)胞系淋巴瘤細(xì)胞株Raji細(xì)胞
3、表面表達(dá)CD137及CD137L,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過激活其表面的CD137L或CD137能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、降低細(xì)胞凋亡、減弱抗癌藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)。最近一項(xiàng)研究運(yùn)用冰凍免疫組化技術(shù)檢測(cè)了36例惡性腫瘤原發(fā)灶中CD137及CD137L的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)15例CD137的表達(dá)為陽(yáng)性(染色細(xì)胞數(shù)大于10%),21例CD137L的表達(dá)為陽(yáng)性;其中16例中低分化的腫瘤組織,11例CD137的表達(dá)為陽(yáng)性,12例CD137L,的表達(dá)為陽(yáng)性。并且,CD137
4、表達(dá)于腫瘤組織血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表面,CD137L表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面。而在15例人體良性腫瘤組織中,僅2例檢測(cè)出CD137的陽(yáng)性表達(dá),3例檢測(cè)出CD137L的陽(yáng)性表達(dá),在12例正常組織中均未能檢測(cè)出這兩個(gè)分子的表達(dá)。
CD137L從細(xì)胞表面清除的過程中釋放出可溶性CD137L(soluble CD137L,sCD137L),其釋放過程可以被基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinaseinhi
5、bitor,MMPI)阻斷。Salih等發(fā)現(xiàn)sCD137L在健康人的血清中的表達(dá)水平很低(3.2pg/ml),而在惡性血液病患者血清中sCD137L濃度顯著升高,31例非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)、52例骨髓增生異常綜合癥(myelodysplastic syndrome,MDS)、20例急性髓細(xì)胞性白血病(acute myeloicleukemia,AML)患者血清sCD137L的平均值分別為5
6、7 pg/ml、210 pg/ml、682pg/ml。高濃度的sCD137L可能通過與膜表面CD137L競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn),從而抑制了免疫細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞之間共刺激活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),使機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答功能受損,同時(shí)也減弱了腫瘤細(xì)胞膜表面CD137L的信號(hào)傳導(dǎo),可能有助于腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。高濃度的sCD137L隨循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)端的組織器官,也可能是這些惡性血液病某些病理生理變化的因?yàn)橹弧_M(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)血清sCD137L的濃度與疾病
7、的轉(zhuǎn)歸有一定關(guān)系,血清sCD137L高濃度與MDS的迅速進(jìn)展有關(guān),而血清sCD137L濃度低的患者無進(jìn)展生存時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)42例AML患者的研究發(fā)現(xiàn),M1/M2型AML患者血清sCD137L濃度均值為1470 pg/ml,明顯高于M4/M5型AML(89 pg/ml),并且濃度低的患者治療后較易取得完全緩解。
一般認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,腫瘤細(xì)胞通常低表達(dá)或不表達(dá)共刺激分子從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識(shí)別。人結(jié)腸癌細(xì)胞株Col
8、o 205、HT 29、HCT 116以及多種腫瘤組織細(xì)胞表面均表達(dá)CD137L,并且該分子具有的生物學(xué)活性,能促使腫瘤細(xì)胞增殖、分泌IL-8,降低細(xì)胞凋亡,減弱抗癌藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)。CD137L表達(dá)于多種人體腫瘤組織細(xì)胞表面,CD137則表達(dá)于腫瘤組織血管壁,因此我們推測(cè)CD137/CD137L這一對(duì)共刺激分子在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮一定作用,通過雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移町能具有特殊的生物學(xué)意義。我們運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR
9、及冰凍免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織CD137L的表達(dá),探討這兩項(xiàng)指標(biāo)與各臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)性,揭示CD137L在結(jié)直腸癌發(fā)展中的可能作用,為尋找結(jié)腸癌新的分子標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ);運(yùn)用固定化CD137/Fc刺激CD137L高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo 205,然后運(yùn)用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖,EIASA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-8的濃度,Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外侵襲力,明膠酶譜法分析培養(yǎng)上清中MMP-9的含量,Westernbl
10、otting分析Akt、phospho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表達(dá),進(jìn)一步揭示CD137L對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用,初步探討其可能機(jī)制。
方法
1.收集2007年10月~2008年4月我院手術(shù)切除的結(jié)直腸痛組織標(biāo)本54例及距離腫瘤邊緣10cm處癌旁組織標(biāo)本18例,腫瘤組織經(jīng)病理檢查均為腺癌。54例患者中男性29例,女性25例,年齡22~84歲,中位年齡60歲。結(jié)
11、腸癌38例,直腸癌12例,直腸乙狀結(jié)腸交界癌4例。28例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織切除后30m內(nèi)采集標(biāo)本,放入凍存管,浸泡在RNAlate(R)中,4℃過夜后,-80℃保存待測(cè),用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)CD137L mRNA的表達(dá)。
2.同時(shí)切取黃豆大小腫瘤組織及癌旁組織,加少許冰凍切片包埋劑用鋁箔包裹,浸沒于液氮中速凍成塊后置-80℃保存,用于冰凍切片免疫組化檢測(cè)CD137L蛋白在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的表達(dá)。
12、 3.由2位病理醫(yī)師在不知道任何臨床和病理資料的情況下對(duì)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。免疫組化結(jié)果判斷采用半定量的方法。染色強(qiáng)度無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例,<5%為0分,5~10%為1分,11~50%為2分,>50%為3分。將染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞得分相乘,0分為“-”,1~2分為“+”,3~-,5分為“++”,6分以上為“+++”。我們將“-~+”定義為蛋白低表達(dá),將“++~+++”定義
13、為蛋白高表達(dá)。采用x2檢驗(yàn)分析CD137L蛋白表達(dá)與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系。
4.運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)本室保存的結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo 205細(xì)胞表面CD137L的表達(dá)。為進(jìn)一步探討CD137L在結(jié)腸癌組織微環(huán)境中可能發(fā)揮的作用,運(yùn)用結(jié)腸癌細(xì)胞株Colo 205進(jìn)一步研究CD137L對(duì)腫瘤細(xì)胞可能發(fā)揮的生物學(xué)作用。
5.Colo 205細(xì)胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)24h、48h、
14、72h后,運(yùn)用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞的增殖情況。
6.Colo 205細(xì)胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后,ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-8的濃度。
7.Matrigel中分別加入CD137/Fc(終濃度為2μg/ml)或Human IgG1 Fc(終濃度為1μg/ml),然后包被到transwell小室底部膜的上室面。Colo 205細(xì)胞加入transwell上室,培養(yǎng)4
15、8h后,將小室取出,輕輕擦去上室內(nèi)未穿過濾膜的細(xì)胞,固定染色后,在200倍光鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿透細(xì)胞,其均值代表侵襲力。
8.Colo 205細(xì)胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)48h后,明膠酶譜法分析培養(yǎng)上清中MMP-9的含量。
9.Colo 205細(xì)胞在未包被、CD137/Fc或IgG1 Fc包被的培養(yǎng)板中培養(yǎng)12h后,Western blotting分析Akt、phos
16、pho-Akt、p38、phospho-p38、ERK及phospho-ERK的表達(dá)情況。
結(jié)論
1.CD137L mRNA及蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織,CD137L蛋白表達(dá)于結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞表面,且在Dukes C期、Dukes B期的表達(dá)最強(qiáng),Dukes D期次之,Dukes A期最弱,提示該分子可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生進(jìn)展中有特殊的生物學(xué)意義。
2.CD137L蛋白在癌旁組織
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