結(jié)直腸癌中新的細(xì)胞亞群NCCC的分離與生物學(xué)功能的研究.pdf

1、第一部分 目的:在活細(xì)胞內(nèi),通過準(zhǔn)確而有效的方法,將ki67high和ki67low/-兩個(gè)細(xì)胞亞群區(qū)別并分選出來,為研究?jī)烧吖δ芴峁┓€(wěn)定的體系。
　　方法:構(gòu)建ki67啟動(dòng)子(-1182~+575)驅(qū)動(dòng)綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的慢病毒系統(tǒng),包裝病毒后感染腫瘤細(xì)胞;將陽性克隆注射于裸鼠皮下,4-6周后處死裸鼠收獲移植瘤,處理成單細(xì)胞懸液后用流式細(xì)胞儀分選出GFP+和GFPlow/-的細(xì)胞,再鑒定其ki67的表達(dá),檢測(cè)GFP能否

2、反映ki67內(nèi)源性表達(dá)。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建了ki67啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的慢病毒系統(tǒng);通過該系統(tǒng)分選的GFP+表達(dá)較高的ki67和各種cyclins,GFPlow/-的細(xì)胞低或不表達(dá)ki67和cyclins。
　　結(jié)論:ki67啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的慢病毒系統(tǒng)能夠有效的分選出ki67+和ki67low/-兩個(gè)細(xì)胞亞群。
　　第二部分
　　目的:比較ki67low/-和ki67+兩個(gè)細(xì)胞亞群在成瘤能力,自我更新能

3、力,轉(zhuǎn)移能力,耐化療能力等腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性方面的差異。
　　方法:通過第一部分中的方法,將分選得到的ki67low/-(GFPlow/-)和ki67+(GFP+)進(jìn)行體外的克隆形成試驗(yàn)(cloneformationassay),連續(xù)成球試驗(yàn)(serialsphereformationassay)以及體內(nèi)的有限稀釋試驗(yàn)(limiteddilutionassay)比較ki67low/-和ki67+兩個(gè)細(xì)胞亞群在成瘤能力和自我更新能力

4、;通過脾包膜下注射腫瘤細(xì)胞觀察肝轉(zhuǎn)移比較二者轉(zhuǎn)移能力;通過腹腔注射5-Fu觀察皮下移植瘤的生長(zhǎng),比較二者體內(nèi)耐化療的能力。
　　結(jié)果:ki67low/-(GFPlow/-)較ki67+(GFP+)具有更強(qiáng)的成瘤和自我更新能力;其肝轉(zhuǎn)移的能力也更明顯;對(duì)5-Fu的不敏感。
　　結(jié)論:ki67low/-表現(xiàn)出更顯著的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)特性。
　　第三部分
　　目的:證實(shí)ki67low/-細(xì)胞在臨床結(jié)直腸癌中的存在,探討其

5、與腫瘤的病理即病人預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:收集2005年胃腸外科所有stageIII的結(jié)直腸癌原位腫瘤標(biāo)本,免疫組化染色ki67并統(tǒng)計(jì)其表達(dá),收集相關(guān)臨床信息,追訪病人生存時(shí)間,揭示ki67的表達(dá)與腫瘤病理和病人預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:臨床結(jié)直腸癌中確實(shí)存在ki67表達(dá)異質(zhì)性的細(xì)胞;在stageIII的結(jié)直腸癌中,ki67表達(dá)與病人的性別,年齡和腫瘤性質(zhì)無關(guān),低表達(dá)ki67的腫瘤分化越差,發(fā)生轉(zhuǎn)移可能性越高,低表達(dá)ki67的