MicroRNA-30b對人結(jié)直腸癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制研究.pdf

1、目的和意義：
　　 結(jié)直腸癌（colorectal carcinom，CRC）是我國第三位最常見的惡性腫瘤，并且近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在結(jié)直腸癌發(fā)病早期，90％的病人可通過手術(shù)治療治愈，然而，大部分病人在確診時已是疾病晚期，預(yù)后差。因此，加強結(jié)直腸癌機制的研究，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，是結(jié)直腸癌研究的重要內(nèi)容。
　　 MicroRNA(miRNA)是一種大小約17～25個核苷酸(nucleotide，nt)的非

2、編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白的短序列RNA。miRNA通過與靶基因mRNA的3'UTR非編碼區(qū)(3'untranslated region,3'UTR)互補匹配導(dǎo)致該mRNA的降解而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)大約1000種miRNAs，miRNA具體的生理病理功能，目前仍在探索之中。相關(guān)文獻顯示:1.miRNA可扮演著癌基因或抑癌基因的角色;2.miRNA通過調(diào)控細胞遷移、侵襲、細胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

3、(EMT)、血管生成及細胞凋亡參與腫瘤的轉(zhuǎn)移等進程;3.miRNA可作為生物學(xué)標記物。miRNA參與生物體發(fā)育、細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程，并且miRNA表達失調(diào)可能參與腫瘤的病理過程。近年來，越來越多的證據(jù)表明，在結(jié)腸癌的發(fā)展過程中伴隨著miRNA的表達失調(diào)。有些miRNA通過調(diào)控癌基因或抑癌基因在結(jié)腸癌中起作用，有些癌基因或抑癌基因通過調(diào)控miRNA發(fā)揮作用。
　　 MiRbase數(shù)據(jù)庫顯示，hsa-mir-30b(

4、miR-30b)全長21nt，在多種組織中泛表達，其表達無組織特異性。研究顯示，miR-30b在多種實體瘤的發(fā)生發(fā)展中表達失調(diào)。Wszolek等用微陣列芯片及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)比較侵襲性膀胱癌與非侵襲性膀胱癌中miRNA表達的變化，發(fā)現(xiàn)miR-30b，miR-31，miR-141，miR-200a, miR-200b，miR-200c，miR-205，miR-21在侵襲性膀胱癌組織中表達明顯下降，miR-99a在

5、非侵襲性膀胱癌組織中表達明顯升高，體外侵襲實驗進一步證實miR-30b，miR-31，miR-141與膀胱癌細胞的侵襲性具有明顯相關(guān)性。miR-30b可通過靶基因影響腫瘤的侵襲性。在黑色素瘤中，Gaziel-Sovran等通過微陣列芯片發(fā)現(xiàn)，miR-30b/30d在黑色素瘤中表達升高，并且其高表達水平與腫瘤分期、轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)、miR-30b/30d高表達組較低表達組復(fù)發(fā)率高，總體生存期短。外源性過表達miR-30b/30d可促進黑色素瘤

6、細胞的侵襲及免疫抑制，其機制是miR-30b/30d靶向抑制轉(zhuǎn)移酶GALNT7，引起免疫抑制因子IL-10合成增多，降低免疫細胞的激活及募集，促進細胞侵襲。由此可見，miR-30b在多種腫瘤中發(fā)揮了重要作用。經(jīng)Pubmed等數(shù)據(jù)庫檢索，未檢索到miR-30b在結(jié)腸癌中相關(guān)研究報道。
　　 基于miR-30b的研究現(xiàn)狀，本研究首先通過實時定量RT-PCR鑒定結(jié)腸癌組織中miR-30b的表達特點，初步探討miR-30b在結(jié)腸癌中的表

7、達情況。外源性改變miR-30b的表達水平觀察其對結(jié)腸癌細胞增殖與凋亡的影響，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測及雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證其靶基因，闡明miR-30b在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色，為深入理解結(jié)腸癌發(fā)病的分子機制和尋找新的分子靶向治療靶點提供實驗基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 1.臨床標本收集
　　 收集南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院2005年1月至2010年12月結(jié)直腸癌及對應(yīng)癌旁組織43例，采集前均通過南方醫(yī)科大學(xué)

8、附屬南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準及患者知情同意。所有標本均經(jīng)病理診斷確診為結(jié)腸癌。所有患者術(shù)前尚未接收放化療治療。
　　 2.細胞培養(yǎng)
　　 人結(jié)直腸癌細胞HCT116、SW480采用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，293FT細胞采用5％DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細胞狀態(tài)良好時用于實驗。
　　 3.載體構(gòu)建
　　 (1)慢病毒載體pLVTHM/miR-30b:

9、以人結(jié)直腸癌細胞基因組DNA為模板，擴增miR-30b前體及側(cè)翼序列(510bp)，將該片段克隆至pLVTHM，得到重組質(zhì)粒pLVTHM/miR-30b。
　　 (2) PGL3-SOX43'UTR和PGL3-SOX43'UTR-Mut:以人結(jié)直腸癌細胞基因組DNA為模板，擴增SOX43'UTR(492bp)，將該片段克隆至PGL3-Basic vector，得到種族質(zhì)粒PGL3-SOX43'UTR，將該重組質(zhì)粒進行點突變，得到

10、突變質(zhì)粒PGL3-SOX43'UTR-Mut。
　　 4.慢病毒包裝、濃縮滴度測定
　　 采用碳酸鈣沉淀法，將慢病毒表達載體和包裝載體共轉(zhuǎn)染293FT細胞，培養(yǎng)48～72h后收集病毒上清，超速離心后進行濃縮純化，倍比稀釋法滴度測定。
　　 5.細胞轉(zhuǎn)染
　　 (1)瞬時轉(zhuǎn)染:按LipofectamineTM2000試劑說明書進行。
　　 (2)慢病毒感染:將慢病毒懸液感染結(jié)腸癌細胞，利用流式細胞儀

11、分選獲得GFP+細胞，分別建立過表達miR-30b的結(jié)腸癌細胞株HCT116/miR-30b和SW480/miR-30b。
　　 (3) miRNA與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染:按LipofectamineTM2000試劑說明書進行。24孔板中miRNA的用量為50nM，重組質(zhì)粒PGL3-SOX43'UTR和PGL3-SOX43'UTR-Mut用量為0.5μg，pRL-SV40用量為0.05μg。
　　 6.實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT

12、-PCR)
　　 抽提細胞和組織總RNA，按All-in-OneTM First-Strand cDNA Synthesis Kit及All-in-OneTM qPCR Mix說明書操作，檢測miR-30b的表達;按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)及SYBR9(@) Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO)說明書操作，檢測SOX4 mRNA的表達。通過相對定量以2-ΔΔCt值代表基因的相對表達強度。

13、
　　 7.細胞生物學(xué)實驗
　　 包括MTT實驗，平板克隆形成實驗，軟瓊脂克隆形成實驗檢測miR-30b對結(jié)腸癌細胞增殖的影響。Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)檢測miR-30b對結(jié)腸癌細胞凋亡的影響(Annexin V Flous Staining Kit(Roche))
　　 8.Western blot
　　 抽提細胞總蛋白，BCA法蛋白定量，10％SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫

14、雜交、ECL化學(xué)發(fā)光。
　　 9.雙熒光素酶報告基因檢測
　　 按Dual-Luciferase(@)Reporter Assay System(Promega)說明書進行操作，將熒光素酶報告基因載體瞬時轉(zhuǎn)染48h后，將細胞裂解后檢測，以Firefly Luciferase和Renilla Luciferase活性的比值作為熒光素酶的相對活性
　　 10.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行

15、數(shù)據(jù)分析。miR-30b在癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中表達比較采用配對樣本W(wǎng)ilcoxon符號秩檢驗。MTT實驗采用析因設(shè)計的方差分析。平板克隆、軟瓊脂克隆形成實驗，Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灳捎脙瑟毩颖镜膖檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.miR-30b在結(jié)腸癌中低表達
　　 采用實時定量PCR法檢測43例結(jié)腸癌組織及對應(yīng)癌旁組織中m

16、iR-30b的表達，結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-30b的表達明顯下降。癌組織中miR-30b相對表達的中位數(shù)為0.149，四分位數(shù)間距為0.030至0.309;癌旁組織中miR-30b的相對表達中位數(shù)為0.252，四分位間距為0.078至0.630。配對樣本的Wilcoxon符號秩檢驗示，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)。
　　 2.miR-30b對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)特性的影響
　　 瞬時轉(zhuǎn)染miR-30b mim

17、ics和inhibitor，熒光定量PCR檢測miR-30b的表達，結(jié)果顯示HCT116和SW480在轉(zhuǎn)染miR-30b mimics后，miR-30b的表達分別增高了4.774倍(P=0.001)和7.107倍(P=0.001);轉(zhuǎn)染miR-30b inhibitor后，miR-30b的表達分別下降了83％(P=0.001)和78％(P=0.001)。以上結(jié)果表明，通過瞬時轉(zhuǎn)染miR-30b mimics或miR-30b inhibi

18、tor可有效上調(diào)或下調(diào)miR-30b的表達。
　　 通過MTT實驗檢測miR-30b表達改變對結(jié)腸癌細胞體外生長能力的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-30bmimics5day后，HCT116和SW480細胞的生長速度分別降低了34.4％和22.5％，而轉(zhuǎn)染miR-30binhibitor5day后，兩種細胞的生長速度分別加快了34.3％和33.8％。通過構(gòu)建miR-30b慢病毒表達載體，建立穩(wěn)定細胞株HCT116/miR-30b和

19、SW480/miR-30b，進行平板克隆形成實驗。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，對照組細胞HCT116/pLVTHM克隆形成數(shù)為26.2±2.8個，HCT116/miR-30b組克隆形成數(shù)為11.7±1.1個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.652，P=0.001);對照組SW480/pLVTHM組克隆形成數(shù)為23.2±2.2個，SW480/miR-30b細胞克隆形成數(shù)為12.5±0.8個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.917，P=0.01)。外源性

20、沉默miR-30b可增強結(jié)腸癌細胞的克隆形成能力。軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果顯示，對照組細胞HCT116-p1VTHM克隆形成數(shù)為25.7±2.6個，HCT116/miR-30b組克隆形成數(shù)為10.6±1.2個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.133，P=0.01);對照組SW480-pLVTHM組克隆形成數(shù)為29.2±2.5個，SW480/miR-30b細胞克隆形成數(shù)為14.8±1.0個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.263，P=0.01)。外源性

21、沉默miR-30b后可增強結(jié)腸癌細胞的克隆形成能力。
　　 瞬時轉(zhuǎn)染miR-30b mimics或inhibitor后，Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術(shù)檢測miR-30b對細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，對照組細胞HCT116 MimicsNegative Control(HCT116 Mimics NC)凋亡率為（2.42±0.28）％，HCT116 Mimics組細胞凋亡率為（4.56±0.45）％，差異有統(tǒng)計學(xué)

22、意義(t=-6.994，P=0.002);對照組HCT116 Inhibitor Negative Control(HCT116 Inhibitor NC)組細胞凋亡率為（3.36±0.17）％，HCT116 Inhibitor組細胞凋亡率為（2.57±0.22）％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.922，P=0.008)。以上結(jié)果提示，miR-30b參與調(diào)控結(jié)腸癌細胞凋亡:過表達miR-30b可促進結(jié)腸癌細胞凋亡，沉默miR-30b表達能抑

23、制結(jié)腸癌細胞凋亡。
　　 上述結(jié)果表明，過表達miR-30b可抑制結(jié)直腸癌細胞的體外增殖能力，促進細胞凋亡;沉默miR-30b可增強結(jié)直腸癌細胞增殖，抑制細胞凋亡。以上結(jié)果提示，miR-30b在結(jié)腸癌中扮演著候選抑癌基因的角色。
　　 3.在結(jié)腸癌細胞中，SOX4為miR-30b的靶基因。
　　 利用miRBase、TargetScan和miRanda三大數(shù)據(jù)庫對miR-30b進行靶基因預(yù)測，3個數(shù)據(jù)庫均預(yù)測SO

24、X4(SRY(sex determining region Y)-box4)為miR-30b的靶基因。構(gòu)建重組質(zhì)粒PGL3-SOX43'UTR和突變質(zhì)粒PGL3-SOX43'UTR-Mut。將PGL3-SOX43'UTR、PGL3-SOX43'UTR-Mut質(zhì)粒與miR-30bmimics或inhibitor共轉(zhuǎn)染HCT116細胞后，檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)pGL3-SOX43'UTR+mimics NC的相對活性為0.689±0.057

25、，pGL3-SOX43'UTR+miR-30bmimics的相對活性為0.327±0.004，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.815，P＜0.001)。pGL3-SOX43'UTR+inhibitor NC組的相對活性為0.604±0.017，pGL3-SOX43'UTR+miR-30b inhibitor的相對活性為0.804±0.041，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-7.920，P=0.001)。以上結(jié)果表明，miR-30b通過與SOX43'

26、UTR特異性結(jié)合抑制SOX4的表達。
　　 qRT-PCR和western blot法檢測HCT116/pLVTHM和HCT116/miR-30b中SOX4表達情況，結(jié)果表明，相對于HCT116/pLVTHM，SOX4mRNA和蛋白水平在HCT116/miR-30b中明顯下調(diào);沉默miR-30b可顯著上調(diào)SOX4 mRNA和蛋白水平。上述結(jié)果進一步證實，SOX4為miR-30b的靶基因。
　　 結(jié)論：
　　 1.