光甘草定抑制結(jié)直腸癌細胞遷移和誘導凋亡及其分子機制研究.pdf

1、目的：探究光甘草定（glabridin）對人結(jié)直腸癌細胞RKO和HCT116細胞的遷移和凋亡的影響，并探討其可能的分子機制。
　　方法：不同濃度的光甘草定、MLCK抑制劑ML-7、ROCK抑制劑H-1152以及p38通路抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125和PKC激活劑PMA處理RKO和（或）HCT116細胞；采用MTT比色法檢測光甘草定對RKO和HCT116細胞活力的影響，平板克隆實驗檢測光甘草定對結(jié)直腸癌細胞克

2、隆形成能力的影響，通過Hoechst33258染色檢測光甘草定對RKO細胞凋亡的影響；通過細胞劃痕和Transwell實驗觀察光甘草定對RKO和HCT116細胞遷移和侵襲能力的影響；免疫熒光檢測光甘草定處理結(jié)直腸癌細胞后E-cadherin、N-cadherin以及HCT116細胞內(nèi)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的變化。Western blot檢測RKO細胞中凋亡相關蛋白（BCL-2、Bax、Caspase家族），HCT116細

3、胞中緊密連接蛋白ZO-1、occludin，RKO和HCT116細胞中E-cadherin、N-cadherin以及遷移相關蛋白（RhoA、 ROCK、MLCK、MLCP、p-MLC）以及MAPK信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白的表達情況，并加入抑制劑和激活劑分析其可能的機制。
　　結(jié)果：光甘草定作用于RKO和HCT116細胞后，對細胞的增殖、克隆形成能力和遷移、侵襲有明顯抑制作用。光甘草定誘導RKO細胞凋亡，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Pr

4、ocaspase9表達水平和上調(diào)Bax、Caspase3蛋白表達，而對Caspase8蛋白表達影響不明顯。光甘草定處理后，RKO和 HCT116細胞遷移相關蛋白MYPT1磷酸化水平及 MLC磷酸化水平下調(diào)，RKO細胞內(nèi) RhoA、ROCK1、ROCK2表達水平均明顯下調(diào)，而HCT116細胞內(nèi)RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白無明顯變化；為進一步的驗證，我們采用 MLCK的特異性抑制劑ML-7或 ROCK的特異性抑制劑H-1152處理R

5、KO和（或）HCT116細胞，觀察到二者對RKO和（或） HCT116細胞的遷移存在抑制作用且能下調(diào) MLCK、ROCK1或p-MYPT1蛋白的表達，提示光甘草定可能通過抑制 MLCK和ROCK活性而抑制 RKO和（或）HCT116細胞的遷移能力。光甘草定在不同時間點處理結(jié)直腸癌細胞后，兩株細胞中ERK無明顯變化，RKO細胞內(nèi)JNK磷酸化水平先上升后下降，p38通路上調(diào)，而HCT116細胞中JNK通路下調(diào)后恢復，p38通路上調(diào)。加入JN

6、K和p38/MAPK通路抑制劑后能下調(diào)遷移相關蛋白MYPT1和MLC的磷酸化水平，表明光甘草定可能部分通過JNK信號通路，下調(diào)MLC磷酸化水平，從而導致細胞運動能力降低而抑制遷移。光甘草定能抑制RKO和HCT116細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，上調(diào)上皮細胞標志物 E-cadherin，下調(diào)間葉細胞標志物N-cadherin；并且上調(diào)HCT116細胞膜上緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白水平。
　　結(jié)論：光甘草定抑制結(jié)直腸癌RKO