表毛萼甲素與電離輻射誘導結(jié)直腸癌細胞凋亡的相關(guān)分子機制研究.pdf

1、本文主要從以下兩個部分展開論述：
　　第一部分
　　表毛萼甲素通過ERK1/2及JNK信號通路誘導結(jié)腸癌細胞凋亡的實驗研究
　　目的：
　　研究表毛萼甲素誘導人結(jié)腸癌細胞Caco-2凋亡的分子機制。
　　方法：
　　1.利用CCK-8細胞增殖實驗檢測表毛萼甲素對結(jié)腸癌細胞Caco-2生長的抑制效應(yīng);
　　2.利用Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞術(shù)觀察表毛萼甲素對結(jié)腸癌細胞Caco-2細胞凋亡

2、的誘導作用;
　　3.利用Hoechst33342熒光染色檢測表毛萼甲素處理后結(jié)腸癌Caco-2細胞凋亡程度;
　　4.利用流式細胞術(shù)檢測表毛萼甲素對結(jié)腸癌Caco-2細胞線粒體膜電位變化的影響;
　　5.ROS（活性氧）熒光探針流式細胞術(shù)檢測表毛萼甲素對結(jié)腸癌Caco-2細胞內(nèi)ROS激活的影響;
　　6.Western blot分析表毛萼甲素對結(jié)腸癌Caco-2細胞內(nèi)信號通路中蛋白激酶表達量及磷酸化程度(Akt

3、，JNK，ERK1/2，P38及p-Akt，p-JNK，p-ERK1/2,p-P38)的影響;
　　7.Western blot檢測表毛萼甲素對結(jié)腸癌Caco-2細胞內(nèi)凋亡相關(guān)caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達量變化的影響;
　　8.Hoechst33342熒光染色檢測EpiA處理、ROS抑制以及JNK或ERK1/2磷酸化阻斷對人結(jié)腸癌Caco-2細胞凋亡的影響;
　　9.Western blot檢測ROS

4、抑制對EpiA下調(diào)JNK與ERK1/2信號通路的影響;
　　10.Western blot檢測EpiA處理、ROS抑制以及JNK或ERK1/2磷酸化阻斷對人結(jié)腸癌Caco-2細胞內(nèi)caspases及Bcl-2/Bax凋亡蛋白表達的影響;
　　11.Western blot檢測EpiA誘導人結(jié)腸癌Caco-2細胞凋亡過程中對pIκBα及cytochrome C的影響。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8細胞增殖實驗證實

5、表毛萼甲素能明顯抑制人結(jié)腸癌Caco-2細胞生長，且抑制效應(yīng)與藥物作用時間及藥物濃度有關(guān);
　　2.Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞術(shù)及Hoeehst33342熒光染色檢測證實表毛萼甲素能夠誘導Caco-2細胞凋亡，1μg/ml表毛萼甲素處理24小時，細胞凋亡率可達41.6％;
　　3.Hoeehst33342熒光染色實驗表明用SP600125及PD98059分別抑制JNK及ERK1/2信號通路能阻滯EpiA誘導的Cac

6、o-2細胞凋亡;
　　4.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果證實表毛萼甲素引起結(jié)腸癌Caco-2細胞線粒體膜電位下降;
　　5.ROS熒光探針及流式細胞術(shù)檢測表明表毛萼甲素隨濃度增加劑量依賴性的提高結(jié)腸癌Caco-2細胞內(nèi)ROS的水平;
　　6.Western blot檢測分析證實，Caco-2細胞經(jīng)表毛萼甲素處理后p-ERK（磷酸化-ERK）及p-JNK（磷酸化-JNK）含量隨表毛萼甲素濃度增加而逐漸降低，細胞內(nèi)Akt、P38、ER

7、K、JNK、p-Akt(磷酸化-Akt)和p-P38(磷酸化-P38)水平無明顯變化;
　　7.Western blot分析表明，Caco-2細胞經(jīng)EpiA處理后caspase-3與Bax蛋白表達水平隨表毛萼甲素濃度增加而逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達水平隨表毛萼甲素濃度增加而逐漸下降;
　　8.Hoeehst33342熒光染色證實NAC組與1μg/mlEpiA+NAC組Caco-2細胞凋亡率未見顯著改變，細胞凋亡率比1μg

8、/ml EpiA處理組明顯降低;SP600125（JNK抑制劑）能誘導Caco-2細胞凋亡，凋亡率較0μg/ml EpiA處理組下降，較1μg/ml EpiA處理組顯著升高;PD98059(ERK1/2抑制劑)能誘導Caco-2細胞凋亡，凋亡率較0μml EpiA處理組下降，較1μg/mlEpiA處理組顯著升高;
　　9.Western blot結(jié)果表明1μg/mlEpiA聯(lián)合NAC處理Caco-2細胞即(1+NAC)組磷酸化-J

9、NK（p-JNK）與磷酸化-ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達水平較1μg/mlEpiA明顯升高;與0μg/mlEpiA處理組無統(tǒng)計學差異;
　　10.Western blot結(jié)果表明1μg/ml EpiA處理Caco-2細胞后caspase-3及Bax表達上調(diào)而Bcl-2表達下調(diào)，用SP600125（JNK抑制劑）及PD98059(ERK1/2抑制劑)阻斷JNK及ERK1/2信號通路后誘導Caco-2細胞caspase-3

10、，Bax表達上調(diào)水平比0μg/ml EpiA組高比1μg/ml EpiA組低，Bcl-2表達下調(diào)水平比0μg/ml EpiA組高比1μg/ml EpiA組低。聯(lián)合NAC后1μg/ml EpiA處理組 caspase-3及Bax、Bcl-2蛋白表達水平與0μg/ml EpiA組無變化，即1μg/mlEpiA誘導的caspase-3及Bax表達上調(diào)與Bcl-2表達下調(diào)受到顯著抑制;
　　11.Western blot結(jié)果表明EpiA處

11、理后Caco-2細胞內(nèi)pIκ Bα表達水平遞減，有劑量相關(guān)性;cytochrome C表達有遞增趨勢，亦呈劑量相關(guān)性。1μg/mlEpiA處理細胞內(nèi)pIκBα表達水平顯著下降，再加入NAC預(yù)處理pIκBα表達水平顯著上調(diào)，EpiA對pIκBα表達的抑制被顯著逆轉(zhuǎn);合并加入20μmol/LPD98059(ERK1/2抑制劑)與40μmol/L SP600125（JNK抑制劑）后，細胞內(nèi)pIκBα表達水平亦顯著下降。
　　結(jié)論及意義：

12、
　　表毛萼甲素可劑量依賴性的提高Caco-2細胞內(nèi)ROS的水平，可劑量相關(guān)的上調(diào)Caco-2細胞內(nèi)ROS的水平并下調(diào)MAPK家族中ERK1/2與JNK的磷酸化，抑制ERK/MAPK及JNK/MAPK信號通路，進而抑制細胞內(nèi)pIκBα表達水平，NF-kB的解離與核轉(zhuǎn)錄下調(diào)，其下游凋亡蛋白Bcl-2的表達亦受到抑制，Bcl-2及Bax的表達及構(gòu)型變化促使線粒體PT孔開放，線粒體膜電位下降至崩潰后，細胞色素C釋放，后激活caspase

13、-3誘導Caco-2線粒體途徑細胞凋亡。值得注意的是，表毛萼甲素對Caco-2細胞的促凋亡作用可被抗氧化劑NAC完全逆轉(zhuǎn)。本實驗揭示了表毛萼甲素抑制結(jié)腸癌腫瘤細胞生長、誘導細胞凋亡的具體機制，為未來該新型化合物參與結(jié)直腸癌的輔助治療提供了確切的生物學依據(jù)與理論基礎(chǔ)，為結(jié)直腸癌抗腫瘤的藥物治療提供了新的途徑。
　　第二部分
　　電離輻射上調(diào)β6激活ERK/MAPK通路誘導結(jié)直腸癌細胞高侵襲表型及放療抵抗的實驗研究
　　目

14、的：
　　探討整合素β6在結(jié)直腸癌放射治療中調(diào)控其惡性進展及放療抵抗的具體分子機制。
　　方法：
　　1.利用Transwell侵襲實驗檢測結(jié)腸癌細胞HT-29，WiDr與Caco-2經(jīng)受放療0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy電離輻射(IR)處理后IR組與未經(jīng)電離輻射處理Non IR組體外侵襲能力;6Gy IR處理WiDr、HT-29及Caco-2細胞后，在不同時間點6h、8h、16h、24h觀察WiDr、HT-2

15、9及Caco-2細胞體外侵襲能力;
　　2.利用逆轉(zhuǎn)錄PCR與Western blot實驗檢測結(jié)腸癌HT-29，WiDr與Caco-2細胞整合素亞基αv及β6的mRNA和蛋白表達情況;利用RT-PCR與Western blot實驗檢測結(jié)腸癌HT-29在電離輻射梯度0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy照射下mRNA和蛋白表達情況;
　　3.人工合成3條雙鏈不同序列的小干擾RNA(small interfering RNA，s

16、iRNA)，通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染導入表達β6的結(jié)腸癌細胞HT-29及WiDr后24h后，用RT-PCR檢測β6 mRNA水平，篩選出能有效抑制β6表達的siRNA序列。利用Transwell侵襲實驗檢測結(jié)腸癌HT-29各設(shè)定組(1) Control(2) AIIB2（抗αvβ1）(3) LM609(抗αvβ3)(4) F1P6(抗αvβ5)(5) IgG1(6)10D5(抗αvβ6)(7) IgG2a經(jīng)IR6Gy處理前后的體外侵襲水平

17、變化，標準單克隆抗體IgG2a和IgG1作為陰性對照。利用Transwell侵襲實驗檢測結(jié)腸癌HT-29(1) Control(2) siβ6(3)siNC(4)10D5(5) IgG2a(6) PD98059組IR6Gy處理前后的體外侵襲水平變化;
　　4.Western blot實驗檢測梯度劑量電離輻射0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8 Gy對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9與MMP-2的影響;Western blot實驗檢測電離輻射

18、下結(jié)腸癌HT-29各設(shè)定組(1)Non IR(2) IR(3)IR+siβ6(4) IR+siNC(5) IR+IgG2a(6) IR+10D5組中MMP2與MMP9的蛋白表達，IR劑量為6Gy電離輻射;
　　5.Western blot實驗檢測不同IR劑量0Gy、2Gy及6Gy下人結(jié)腸癌HT-29細胞MAPK信號傳導通路關(guān)鍵因子ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-38的蛋白表達活化情況;Western blot實

19、驗分別檢測人結(jié)腸癌HT-29(1)Non IR(2)IR(3) IR+siβ6(4) IR+10D5(5) IR+siNC(6) IR+IgG2a組各自細胞MAPK信號傳導通路表達情況，IR劑量為6Gy電離輻射;
　　6.裸鼠分Non IR組、IR組、IR+10D5(αvβ6單克隆抗體)組、IR+IgG isotype組，皮下種植等量結(jié)腸癌HT-29細胞，待瘤體長到約0.8-1cm左右，瘤旁注射10D5(10mg/kg，一天一次)

20、或IgG isotype，放射治療組給予20Gy分割輻射劑量，觀察其成瘤能力的變化，3周后取瘤體，用游標卡尺測量小鼠皮下腫瘤最長徑(a)和最短徑(b)(精確0.1mm)，計算并觀察各組腫瘤體積變化(V=0.5ab2)，TUNEL免疫組化染色檢測細胞凋亡;
　　7.Caco-2結(jié)腸癌細胞分為已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含β6基因質(zhì)粒組(Caco-2β6-transfectant)、轉(zhuǎn)染含β6突變基因質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染表達的β6蛋白缺失與ERK2的結(jié)合位點）

21、（Caco-2β6 Mutant-transfectant）和轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(Caco-2Mock-transfectant);6Gy電離輻射作用于Caco-2各組細胞，Western bloting實驗檢測MMP9蛋白表達及凋亡相關(guān)分子Bcl-2和Bax表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.電離輻射(IR)可促進WiDr、HT-29細胞在Transwell小室上的侵襲能力，在IR6Gy劑量處理下為WiDr、HT-29細胞體外侵襲

22、能力峰值，對結(jié)腸癌細胞Caco-2體外侵襲能力無明顯影響;電離輻射(IR)6Gy劑量處理WiDr、HT-29及Caco-2細胞后，在不同時間點6h、8h、16h、24h觀察到WiDr、HT-29體外侵襲能力均有顯著提升，而Caco-2細胞體外侵襲能力未見顯著性改變;
　　2.逆轉(zhuǎn)錄PCR與Western blot實驗結(jié)果表明:結(jié)腸癌細胞HT-29，WiDr表達整合素β6，而結(jié)腸癌細胞Caco-2不表達整合素β6，三組細胞整合素αv

23、的表達無明顯差異。IR梯度照射能顯著上調(diào)結(jié)腸癌細胞HT-29中整合素β6mRNA及蛋白的表達，6Gy劑量可達峰值。IR對結(jié)腸癌細胞HT-29整合素αv表達無影響;
　　3.Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，αvβ6功能阻斷抗體10D5可顯著抑制HT-29細胞體外侵襲能力(P＜0.05); IR與10D5合用后，此種抑制作用顯著增強(P＜0.01)，而整合素αvβ1、αvβ3與αvβ5的單克隆抗體AIIB2、LM609和F1P6則

24、對HT-29細胞的體外侵襲能力無顯著的抑制效應(yīng)(P＞0.05); siRNA介導抑制β6表達顯著下調(diào)電離輻射后結(jié)腸癌細胞HT-29的體外侵襲能力，信號通路特異性ERKI/2抑制劑PD98059能明顯抑制IR誘發(fā)的結(jié)腸癌細胞HT-29體外侵襲（P＜0.05）;
　　4.Western blot實驗表明梯度劑量IR能顯著上調(diào)HT-29中MMP-9的表達(P＜0.05 vs Non IR組)，不同劑量電離輻射0Gy、2Gy、4Gy、6G

25、y、8 Gy對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9蛋白的表達影響不同;梯度劑量IR對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2表達沒有顯著影響（P＞0.05）。整合素β6特異性siRNA沉默基因表達或αvβ6特異性功能抑制劑10D5預(yù)處理HT-29細胞后，能明顯抑制IR對MMP-9蛋白表達的上調(diào)作用(P＜0.05 vs Non IR組);對MMP-2蛋白表達沒有顯著影響(P＞0.05);
　　5.Western blot實驗結(jié)果表明，IR能誘導HT-29細胞中

26、p-ERK1/2高表達(P＜0.05vs Non IR組)，但不影響t-ERK1/2、p-JNK、p-p38、t-JNK和t-p38的表達(P＞0.05)。siRNA介導β6基因沉默或10D5抗體封閉αvβ6功能后，都可顯著抑制IR誘導的p-ERK高表達(P＜0.05 vs Non IR組)，對t-ERK1/2、p-JNK、p-p38、t-JNK和t-p38的表達沒有影響(P＞0.05);
　　6.種植后3周，Non IR組細胞形

27、成腫瘤平均體積約為(361±17.23) mm3，IR組(284±14.97) mm3、IR+10D5組(61±7.79) mm3、IR+IgG isotype組約為(265±13.74)mm3，IR+10D5組瘤體體積顯著比Non IR組及IR組小，差異有顯著性（P＜0.05）。TUNEL免疫組化細胞凋亡結(jié)果顯示，IR+10D5組細胞凋亡率顯著高于Non IR組與IR組，提示阻斷整合素β6表達能顯著提升放射治療效果，αvβ6單克隆抗體

28、10D5能顯著增敏結(jié)腸癌放療;
　　7.將整合素β6轉(zhuǎn)染表達于結(jié)腸癌Caco-2細胞后，Western blot檢測實驗結(jié)果顯示，當整合素β6缺失與ERK2的直接連接后，IR作用前后β6介導的Bcl-2表達上調(diào)而Bax表達下調(diào)現(xiàn)象受到顯著抑制，能有效抑制整合素β6介導的結(jié)腸癌細胞的放療抵抗;IR作用前后整合素β6導致的MMP-9表達上調(diào)現(xiàn)象受到顯著抑制，能有效抑制整合素β6介導的結(jié)腸癌細胞對電離輻射的反應(yīng)性高侵襲表型。提示β6在放

29、射治療后介導胞外基質(zhì)降解與放療抵抗并經(jīng)由αvβ6-ERK2直接通路實現(xiàn)。
　　結(jié)論及意義：
　　放療電離輻射可上調(diào)整合素αvβ6陽性細胞的αvβ6表達，通過激活ERK/MAK信號通路并借由β6-ERK2直接連接上調(diào)MMP-9、Bcl-2和下調(diào)Bax蛋白表達，通過MMP-9誘導侵襲呈現(xiàn)惡性生物學表型，通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax傳達亞致死損傷修復(fù)信號，可能通過抑制線粒體凋亡途徑并最終保護結(jié)直腸癌細胞耐受電離輻射誘導的凋亡。本研究