MiR-149調控轉錄因子FOXM1抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲的研究.pdf

1、目的:
　　探討miR-149表達在CRC中的臨床病理意義和預后價值，以及miR-149/FOXM1在CRC細胞遷移和侵襲過程中的功能和機制，為進一步闡明和完善CRC中miR-149表達紊亂及其功能異常的分子調控機制，尋找CRC新的治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法和結果:
　　第一章 MiR-149在CRC中的表達及其臨床意義
　　方法:
　　1.在收集的CRC組織、癌旁組織、正常結腸組織、一系列轉移能力不

2、同的CRC細胞(HCT116、LoVo、SW480)和正常結腸細胞(NCM460)中，利用實時定量RT-PCR檢測miR-149的表達水平。
　　2.結合臨床信息分析全部78例CRC組織中miR-149表達水平與臨床病理特征和預后的關系。
　　3.在收集的CRC組織、癌旁組織和正常結腸組織中，運用實時定量RT-PCR檢測FOXM1的表達水平，并分析其與miR-149表達水平之間的關系。
　　結果:
　　1.CRC

3、組織(n=78)中miR-149的表達水平顯著低于正常結腸組織(n=20)(P＜0.01);與對應癌旁組織(n=20)相比，CRC組織(n=20)中miR-149的表達水平顯著降低(P＜0.01);同時，與無淋巴結或遠處轉移的CRC組織(nmCRC，n=38)相比，有轉移的CRC組織中(mCRC，n=40) miR-149表達水平顯著降低(P＜0.01)。此外，正常結腸細胞株NCM460的miR-149表達水平最高，低轉移性CRC細胞株

4、LoVo和SW480次之，高轉移性CRC細胞株HCT116中，miR-149表達水平最低(P＜0.01)。
　　2.相關性分析發(fā)現(xiàn)，CRC組織中miR-149的表達水平與患者淋巴結轉移(P=0.024)、遠處轉移（P=0.045）、TNM分期(P=0.033)呈顯著相關;Kaplan-Meier生存曲線和Cox風險比例回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，miR-149低表達預示總生存期縮短(P＜0.01)，可作為判斷CRC患者預后的獨立危險因素(P

5、=0.011;HR=2.658;95％ CI:1.308-3.087)。
　　3.CRC組織(n=78)中FOXM1的mRNA表達水平顯著高于正常結腸組織(n=20)(P＜0.01);20對CRC和癌旁組織對比中，癌組織中FOXM1 mRNA表達水平顯著增高(P＜0.01);同時，有淋巴結或遠處轉移的CRC組織(mCRC，n=40)中FOXM1 mRNA表達水平顯著高于無轉移的CRC組織(nmCRC，n=38)(P＜0.01)。此

6、外，F(xiàn)OXM1的表達水平和miR-149表達水平呈負相關(r=-0.553，P＜0.01)。
　　第二章 MiR-149對CRC細胞和正常結腸細胞生物學特性的影響
　　方法:
　　1.通過合成miR-149 mimics和inhibitor并瞬時轉染CRC細胞(HCT116、LoVo)和正常結腸細胞(NCM460)，人為改變細胞內miR-149表達水平，運用MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗分別檢測細

7、胞增殖、遷移和侵襲能力的變化。
　　結果:
　　1.與對照組miR-NC mimics相比，轉染miR-149 mimics的HCT116細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降(P＜0.01)。相反，在LoVo細胞中人為下調miR-149表達水平，可增強細胞的增殖、遷移和侵襲能力(P＜0.05)。
　　2.下調正常結腸細胞NCM460中miR-149表達水平，可增強細胞的遷移和侵襲能力（P＜0.05）。
　　第三章

8、MiR-149靶向調控CRC細胞FOXM1基因的表達
　　方法:
　　1.運用三個不同的miRNA/靶基因在線分析軟件TargetScan(http://www.targetsean.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和miRNAtargets(http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/)，分析FOXM1 mRNA3'-UTR序列中潛在的miRNA結

9、合位點，將預測結果作交集分析。
　　2.將miR-149 mimics、inhibitor及其對照分別與含F(xiàn)OXM1-3'-UTR-wt和FOXM1-3'-UTR-mut序列的熒光素酶質粒載體瞬時共轉染HCT116細胞，運用熒光素酶活性實驗，根據(jù)熒光素酶活性變化鑒定miR-149是否能與FOXM13'-UTR序列結合。
　　3.運用實時定量RT-PCR和Western blot驗證miR-149對FOXM1的調控作用。

10、>　　結果:
　　1.通過生物信息學軟件和交集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1 mRNA3'-UTR序列上存在miR-149的潛在結合位點。
　　2.熒光素酶活性實驗發(fā)現(xiàn)，miR-149能與FOXM1 mRNA3'-UTR序列結合，使熒光強度顯著下降。
　　3.MiR-149能直接靶向調控FOXM1基因的表達。
　　第四章 MiR-149調控CRC細胞侵襲轉移的機制研究
　　方法:
　　1.構建FOXM1干擾質粒

11、(pSil/shFOXM1)并穩(wěn)定轉染HCT116和LoVo細胞，人為下調細胞內FOXM1的表達水平，采用MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗檢測各組細胞增殖、遷移和侵襲能力的差異。
　　2.構建FOXM1基因真核表達載體(pEGFP/FOXM1)與空質粒對照(pEGFP/control)分別轉染HCT116/miR-149 mimics細胞，實時定量RT-PCR和western blot技術檢測FOXM1 mRN

12、A和蛋白表達水平的變化。MTT實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗分析各組細胞增殖、遷移和侵襲能力的差異。
　　3.運用實時定量RT-PCR和Western blot技術分別檢測HCT116/miR-149 mimics、HCT116/shFOXM1及其對照細胞中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表達水平。FOXM1基因真核表達載體(pEGFP/FOXM1)與空質粒對照（pEGFP/cont

13、rol）分別轉染HCT116/miR-149 mimics細胞，實時定量RT-PCR和Western blot技術檢測MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表達水平。
　　4.實時定量RT-PCR檢測miR-149高表達組(n=33)和miR-149低表達組（n=-45）CRC組織中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表達水平。
　　結果:
　　1.HCT116/shFOX

14、M1和LoVo/shFOXM1細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降。提示阻斷FOXM1的表達可模擬miR-149對CRC細胞的生物學效應。
　　2.FOXM1表達恢復可部分逆轉miR-149過表達所介導的對CRC細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示miR-149對CRC細胞生物學特性的作用部分是由FOXM1介導的，F(xiàn)OXM1是miR-149重要的功能性靶基因。
　　3.上調miR-149或下調FOXM1均能抑制CRC細胞

15、MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的表達?；謴虵OXM1表達能逆轉miR-149過表達對CRC細胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR表達的抑制作用。
　　4.MiR-149低表達組(n=45)CRC組織中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表達水平均高于miR-149高表達組(n=33)。
　　結論和意義:
　　1.MiR-149在CRC組織尤其是有淋巴結或遠處轉移的組織中低

16、表達，F(xiàn)OXM1在CRC組織中高表達，兩者呈負相關。MiR-149的表達水平與CRC患者淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期以及臨床預后相關。
　　2.MiR-149可抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　3.MiR-149能與FOXM1 mRNA3'-UTR直接結合并調控FOXM1基因的表達。
　　4.MiR-149對CRC細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用部分是由FOXM1介導的，并與MMP-2、MMP-9、VE

17、GF-A和uPAR密切相關。提示FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因，MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR可能是miR-149/FOXM1影響CRC細胞遷移和侵襲的重要效應分子。
　　5.本研究首次分析了miR-149在CRC中的表達異常及其與臨床病理特征和預后的關系，發(fā)現(xiàn)了miR-149對CRC細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響，并探討了miR-149在CRC細胞中發(fā)揮作用的分子機制。提示miR-149/F