MiR-149調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子FOXM1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的研究.pdf

1、目的:
　　探討miR-149表達(dá)在CRC中的臨床病理意義和預(yù)后價(jià)值，以及miR-149/FOXM1在CRC細(xì)胞遷移和侵襲過程中的功能和機(jī)制，為進(jìn)一步闡明和完善CRC中miR-149表達(dá)紊亂及其功能異常的分子調(diào)控機(jī)制，尋找CRC新的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法和結(jié)果:
　　第一章 MiR-149在CRC中的表達(dá)及其臨床意義
　　方法:
　　1.在收集的CRC組織、癌旁組織、正常結(jié)腸組織、一系列轉(zhuǎn)移能力不

2、同的CRC細(xì)胞(HCT116、LoVo、SW480)和正常結(jié)腸細(xì)胞(NCM460)中，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)miR-149的表達(dá)水平。
　　2.結(jié)合臨床信息分析全部78例CRC組織中miR-149表達(dá)水平與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。
　　3.在收集的CRC組織、癌旁組織和正常結(jié)腸組織中，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)FOXM1的表達(dá)水平，并分析其與miR-149表達(dá)水平之間的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.CRC

3、組織(n=78)中miR-149的表達(dá)水平顯著低于正常結(jié)腸組織(n=20)(P＜0.01);與對(duì)應(yīng)癌旁組織(n=20)相比，CRC組織(n=20)中miR-149的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01);同時(shí)，與無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC組織(nmCRC，n=38)相比，有轉(zhuǎn)移的CRC組織中(mCRC，n=40) miR-149表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。此外，正常結(jié)腸細(xì)胞株NCM460的miR-149表達(dá)水平最高，低轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞株

4、LoVo和SW480次之，高轉(zhuǎn)移性CRC細(xì)胞株HCT116中，miR-149表達(dá)水平最低(P＜0.01)。
　　2.相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CRC組織中miR-149的表達(dá)水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.024)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.045）、TNM分期(P=0.033)呈顯著相關(guān);Kaplan-Meier生存曲線和Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，miR-149低表達(dá)預(yù)示總生存期縮短(P＜0.01)，可作為判斷CRC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P

5、=0.011;HR=2.658;95％ CI:1.308-3.087)。
　　3.CRC組織(n=78)中FOXM1的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)腸組織(n=20)(P＜0.01);20對(duì)CRC和癌旁組織對(duì)比中，癌組織中FOXM1 mRNA表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01);同時(shí)，有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC組織(mCRC，n=40)中FOXM1 mRNA表達(dá)水平顯著高于無轉(zhuǎn)移的CRC組織(nmCRC，n=38)(P＜0.01)。此

6、外，F(xiàn)OXM1的表達(dá)水平和miR-149表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.553，P＜0.01)。
　　第二章 MiR-149對(duì)CRC細(xì)胞和正常結(jié)腸細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　方法:
　　1.通過合成miR-149 mimics和inhibitor并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞(HCT116、LoVo)和正常結(jié)腸細(xì)胞(NCM460)，人為改變細(xì)胞內(nèi)miR-149表達(dá)水平，運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)

7、胞增殖、遷移和侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組miR-NC mimics相比，轉(zhuǎn)染miR-149 mimics的HCT116細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著下降(P＜0.01)。相反，在LoVo細(xì)胞中人為下調(diào)miR-149表達(dá)水平，可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(P＜0.05)。
　　2.下調(diào)正常結(jié)腸細(xì)胞NCM460中miR-149表達(dá)水平，可增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力（P＜0.05）。
　　第三章

8、MiR-149靶向調(diào)控CRC細(xì)胞FOXM1基因的表達(dá)
　　方法:
　　1.運(yùn)用三個(gè)不同的miRNA/靶基因在線分析軟件TargetScan(http://www.targetsean.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和miRNAtargets(http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/)，分析FOXM1 mRNA3'-UTR序列中潛在的miRNA結(jié)

9、合位點(diǎn)，將預(yù)測(cè)結(jié)果作交集分析。
　　2.將miR-149 mimics、inhibitor及其對(duì)照分別與含F(xiàn)OXM1-3'-UTR-wt和FOXM1-3'-UTR-mut序列的熒光素酶質(zhì)粒載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，運(yùn)用熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)熒光素酶活性變化鑒定miR-149是否能與FOXM13'-UTR序列結(jié)合。
　　3.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot驗(yàn)證miR-149對(duì)FOXM1的調(diào)控作用。

10、>　　結(jié)果:
　　1.通過生物信息學(xué)軟件和交集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXM1 mRNA3'-UTR序列上存在miR-149的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-149能與FOXM1 mRNA3'-UTR序列結(jié)合，使熒光強(qiáng)度顯著下降。
　　3.MiR-149能直接靶向調(diào)控FOXM1基因的表達(dá)。
　　第四章 MiR-149調(diào)控CRC細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究
　　方法:
　　1.構(gòu)建FOXM1干擾質(zhì)粒

11、(pSil/shFOXM1)并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HCT116和LoVo細(xì)胞，人為下調(diào)細(xì)胞內(nèi)FOXM1的表達(dá)水平，采用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的差異。
　　2.構(gòu)建FOXM1基因真核表達(dá)載體(pEGFP/FOXM1)與空質(zhì)粒對(duì)照(pEGFP/control)分別轉(zhuǎn)染HCT116/miR-149 mimics細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和western blot技術(shù)檢測(cè)FOXM1 mRN

12、A和蛋白表達(dá)水平的變化。MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分析各組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的差異。
　　3.運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)HCT116/miR-149 mimics、HCT116/shFOXM1及其對(duì)照細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表達(dá)水平。FOXM1基因真核表達(dá)載體(pEGFP/FOXM1)與空質(zhì)粒對(duì)照（pEGFP/cont

13、rol）分別轉(zhuǎn)染HCT116/miR-149 mimics細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　4.實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)miR-149高表達(dá)組(n=33)和miR-149低表達(dá)組（n=-45）CRC組織中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.HCT116/shFOX

14、M1和LoVo/shFOXM1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降。提示阻斷FOXM1的表達(dá)可模擬miR-149對(duì)CRC細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　2.FOXM1表達(dá)恢復(fù)可部分逆轉(zhuǎn)miR-149過表達(dá)所介導(dǎo)的對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。提示miR-149對(duì)CRC細(xì)胞生物學(xué)特性的作用部分是由FOXM1介導(dǎo)的，F(xiàn)OXM1是miR-149重要的功能性靶基因。
　　3.上調(diào)miR-149或下調(diào)FOXM1均能抑制CRC細(xì)胞

15、MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的表達(dá)?；謴?fù)FOXM1表達(dá)能逆轉(zhuǎn)miR-149過表達(dá)對(duì)CRC細(xì)胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR表達(dá)的抑制作用。
　　4.MiR-149低表達(dá)組(n=45)CRC組織中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表達(dá)水平均高于miR-149高表達(dá)組(n=33)。
　　結(jié)論和意義:
　　1.MiR-149在CRC組織尤其是有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織中低

16、表達(dá)，F(xiàn)OXM1在CRC組織中高表達(dá)，兩者呈負(fù)相關(guān)。MiR-149的表達(dá)水平與CRC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以及臨床預(yù)后相關(guān)。
　　2.MiR-149可抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。
　　3.MiR-149能與FOXM1 mRNA3'-UTR直接結(jié)合并調(diào)控FOXM1基因的表達(dá)。
　　4.MiR-149對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用部分是由FOXM1介導(dǎo)的，并與MMP-2、MMP-9、VE

17、GF-A和uPAR密切相關(guān)。提示FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因，MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR可能是miR-149/FOXM1影響CRC細(xì)胞遷移和侵襲的重要效應(yīng)分子。
　　5.本研究首次分析了miR-149在CRC中的表達(dá)異常及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了miR-149對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，并探討了miR-149在CRC細(xì)胞中發(fā)揮作用的分子機(jī)制。提示miR-149/F