NGX6負(fù)調(diào)控SAPK-JNK通路抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子和CylinD1表達(dá)的研究.pdf

1、結(jié)直腸癌(Colorectal Callcer CRC)是常見消化道惡性腫瘤。迄今，結(jié)直腸癌的確切發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，但目前普遍認(rèn)為結(jié)直腸癌發(fā)病是一個(gè)涉及多基因、多步驟的復(fù)雜過程。NGX6基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室克隆的一個(gè)侯選抑瘤基因(基因登陸號(hào)：AF188239)，前期研究發(fā)現(xiàn)NGX6在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯下降；它能夠延緩細(xì)胞周期的進(jìn)程；抑制腫瘤增殖和種植瘤的生長(zhǎng)：并能抑制腫瘤血管的生成，下調(diào)VEGF的表達(dá)；使結(jié)腸癌細(xì)胞

2、體外侵襲能力下降，同時(shí)恢復(fù)腫瘤細(xì)胞間隙；并負(fù)調(diào)控。beta-catenin/Wnt通路。且前期基因芯片研究發(fā)現(xiàn)NGX6能使MAPK(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)通路相關(guān)的兩個(gè)基因：MADD(MAP-kinase activating death domain)；Rhoc(Rash homologgene family,member C)的表達(dá)下調(diào)三倍以上，而這兩個(gè)基因主要是與ERK(P

3、42/P44MAPK)通路和SAPK/JNK通路有關(guān)。所以本課題在前期工作的基礎(chǔ)上，從NGX6對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的影響來探討其抑制腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。并且重點(diǎn)研究MAPK通路中ERK(P42/P44MAPK)通路和SAPK/JNK通路中關(guān)鍵分子P-JNK和P-ERK在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義，并進(jìn)一步探討NGX6對(duì)ERK/MAPK通路和SAPK/JNK通路影響和對(duì)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。 P-JNK和P-ERK在結(jié)直腸組織芯

4、片中的表達(dá)本文在336個(gè)點(diǎn)陣的結(jié)直腸組織芯片上，利用免疫組化檢測(cè)P-JNK和P-ERK．蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步分析蛋白陽性表達(dá)與結(jié)直腸組織臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)P-JNK和P-ERK蛋白在癌組織較粘膜的表達(dá)明顯增高。且P-JNK在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)與性別、分化程度、Duke'S分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，P-ERK蛋白陽性表達(dá)在結(jié)直腸癌組織中與分化程度相關(guān)，在癌旁粘膜中與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。然而，P-JNK和P-ERK的蛋白表達(dá)之間沒有相關(guān)性。

5、 NGX6對(duì)SPAK/JNK和ERK/MAPK通路的影響以三組結(jié)腸癌細(xì)胞株(HT-29、pcDNA3.1(+)/HT-29、pcDNA3.1(+)/NGX6/HT-29)為研究對(duì)象。采用Western Blot、免疫熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)NGX6對(duì)JNK、P-JNK、ERK、P-ERIC蛋白質(zhì)表達(dá)和核移位的影響。結(jié)果證實(shí)：過表達(dá)NGX6基因能抑制HT-29細(xì)胞中JNK1/2的活化和核移位，使P-JNK1在胞漿聚集，入核減少：

6、但卻并不能抑制ERK1/2的活化和核移位。 NGX6對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子AP-1(c-Jun、c-fos)、Ets-1的影響通過Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染NGX6基因后HT-29細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子AP-1(c-Jun、c-fos)、Ets-1的蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯下調(diào)；提示NGX6可以抑制MAPK通路的下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。予以信號(hào)通路抑制劑分別抑制ERK及腫<信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)ERK及JNK信號(hào)通路均可調(diào)控c-Jun、Ets-1表達(dá)，但c-

7、fos主要受ERK路的調(diào)控，JNK通路只能部分抑制抑制c-fos表達(dá)。說明NGX6可能是通過SPAK/JNK通路來抑制核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)NGX6對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系中Mark通路的關(guān)鍵分子AP-1的活性的影響。發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了NGX6的SW620細(xì)胞系中AP-1的活性明顯下降。 NGX6對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinDl的影響Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染NGX6基因?qū)?xì)胞周期調(diào)控蛋白Cyclin

8、D1的蛋白質(zhì)表達(dá)的影響；熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)NGX6對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系中CyclinD1活性的改變。結(jié)果顯示NGX6能夠抑制CyclinD1蛋白質(zhì)表達(dá)并下調(diào)CyclinD1轉(zhuǎn)錄活性。 綜上所述：本研究證實(shí)了SPAK/JNK通路和ERK/MAPK通路中關(guān)鍵分子P-JNK和P-ERK在結(jié)直腸癌中活化增強(qiáng)，而NGX6可以通過SPAK/JNK通路負(fù)調(diào)控結(jié)直腸癌的核轉(zhuǎn)錄因子及抑制AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，并通過抑制具有AP-1結(jié)合