炎癥因子TNF-α作用于轉(zhuǎn)錄因子FoxM1促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　肝癌是世界常見腫瘤之一。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，炎性微環(huán)境在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤進(jìn)展、血管生成和侵襲中發(fā)揮了重要的作用。在腫瘤相關(guān)炎性細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子中，TNF-α被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，并參與了腫瘤的發(fā)展發(fā)展。然而，TNF-α是如何促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制尚需深入研究。有研究顯示HIF-1α在炎癥過程中可能會參與相關(guān)基因的調(diào)節(jié)。而我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧情況下HIF-1α可以誘導(dǎo)FoxM1表達(dá)升高，后者可促進(jìn)肝癌細(xì)

2、胞的增殖。
　　FoxM1(ForkheadboxM1)是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，該家族具有相似的翼螺旋DNA結(jié)合域。在增生的上皮細(xì)胞中，F(xiàn)oxM1普遍表達(dá)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)oxM1調(diào)控G1/S、G2/M期周期調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄，敲除FoxM1可引起細(xì)胞周期阻滯、有絲分裂紡錘體缺陷和染色體的錯(cuò)誤聚集。
　　除了影響細(xì)胞增生外，一些研究發(fā)現(xiàn)FoxM1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近期有報(bào)道稱，F(xiàn)oxM1高表達(dá)預(yù)示肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后不良。敲除F

3、oxM1后，小鼠肝細(xì)胞停止增殖，并較難在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)下形成腫瘤。同時(shí)，F(xiàn)oxM1轉(zhuǎn)錄活性特異性抑制短肽，p19ARF，可抑制肝細(xì)胞增殖，并引起肝癌細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果都提示FoxM1可能是肝癌細(xì)胞增殖存活的重要調(diào)控分子，然而其具體的分子機(jī)制至今尚不完全清楚。
　　【目的】
　　1、研究TNF-α誘導(dǎo)下，肝癌細(xì)胞中FoxM1的表達(dá)及調(diào)控信號通路；2、研究TNF-α誘導(dǎo)FoxM1上調(diào)對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響；3、研究FoxM

4、1在肝細(xì)胞肝癌中的臨床意義。
　　【方法】
　　1、運(yùn)用RT-PCR、Westernblot和報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測肝癌細(xì)胞TNF-α誘導(dǎo)后FoxM1的表達(dá)及啟動(dòng)子活性；2、通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)研究TNF-α誘導(dǎo)下FoxM1啟動(dòng)子區(qū)的順勢元件；3、通過ChIP試驗(yàn)證實(shí)在TNF-α誘導(dǎo)下HIF-1α結(jié)合于FoxM1的啟動(dòng)子；4、運(yùn)用RNA干擾和westernblot技術(shù)驗(yàn)證HIF-1α在TNF-α誘導(dǎo)FoxM1表達(dá)中的關(guān)鍵意義；5、通過

5、MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式技術(shù)研究TNF-α誘導(dǎo)的FoxM1高表達(dá)在肝癌細(xì)胞增殖凋亡中的作用；6、通過免疫組化技術(shù)分析FoxM1在肝細(xì)胞肝癌中的臨床意義。
　　【結(jié)果】
　　1、TNF-α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞FoxM1表達(dá)并增強(qiáng)其啟動(dòng)子活性
　　我們首先發(fā)現(xiàn)TNF-α可以明顯上調(diào)肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7中FoxM1的mRNA水平，并呈劑量依賴性。隨后，Westernblot發(fā)現(xiàn)TNF-α同樣可以上調(diào)FoxM1的蛋白表達(dá)

6、水平。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)FoxM1的靶分子cyclinB1,cyclinD1在TNF-α誘導(dǎo)后同樣表達(dá)上調(diào)。報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示TNF-α處理后FoxM1啟動(dòng)子的活性明顯增強(qiáng)，并且也存在呈劑量依賴性。
　　2、TNF-α上調(diào)FoxM1表達(dá)是通過HIF-1α結(jié)合FoxM1的啟動(dòng)子區(qū)
　　前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1啟動(dòng)子區(qū)的HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)在缺氧誘導(dǎo)FoxM1過程中具有重要意義。而在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)FoxM1啟動(dòng)子-330到

7、-58區(qū)對于TNF-α誘導(dǎo)的FoxM1活性亦非常重要。因此，我們將這個(gè)區(qū)域中的四個(gè)HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)分別進(jìn)行了突變，然后報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)其中HIF1α-1和HIF1α-3/4結(jié)合位點(diǎn)的突變可顯著降低FoxM1啟動(dòng)子活性，而且兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的雙突變降低效果更明顯。這些結(jié)果都提示HIF1α-1和HIF1α-3/4結(jié)合位點(diǎn)對TNF-α誘導(dǎo)的FoxM1啟動(dòng)子活性至關(guān)重要。
　　3、HIF-1α在TNF-α誘導(dǎo)下直接結(jié)合于FoxM1啟動(dòng)子區(qū)

8、
　　為了驗(yàn)證TNF-α誘導(dǎo)后HIF-1α是否可直接結(jié)合于FoxM1啟動(dòng)子區(qū)，我們進(jìn)行了結(jié)合/競爭ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)后，HIF-1α的DNA結(jié)合活性顯著升高，而且結(jié)合活性隨著核提取物量的增加而升高。這些結(jié)果提示，TNF-α可增強(qiáng)HIF-1α在肝癌細(xì)胞中的DNA結(jié)合活性。并且競爭實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，在TNF-α處理后，HIF-1α直接結(jié)合于FoxM1啟動(dòng)子區(qū)的HIF1α-1和HIF1α-3/4結(jié)合位點(diǎn)。ChIP實(shí)驗(yàn)也

9、得到了相似的結(jié)果。綜上可說明肝癌細(xì)胞中HIF-1α在TNF-α誘導(dǎo)下可直接結(jié)合于FoxM1啟動(dòng)子區(qū)。
　　4、HIF-1α在TNF-α誘導(dǎo)FoxM1表達(dá)過程中具有重要意義
　　將pGL-FoxM1promoter和HIF-1αsiRNA共轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞HepG2中，24小時(shí)后行報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示干擾HIF-1α表達(dá)可顯著抑制TNF-α對FoxM1啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)作用，westernblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。用HI

10、F-1α的抑制劑YC-1處理轉(zhuǎn)染后細(xì)胞也可得到相似的結(jié)果。定量PCR顯示TNF-α并不影響HIF-1α的mRNA表達(dá)，而westernblot顯示TNF-α可顯著上調(diào)其蛋白表達(dá)，說明TNF-α處理后可增加肝癌細(xì)胞中HIF-1α的穩(wěn)定性，這一現(xiàn)象在TNF-α誘導(dǎo)FoxM1表達(dá)過程中具有重要意義。
　　5、TNF-α誘導(dǎo)HIF-1α活性及FoxM1表達(dá)具有活性氧簇（ROS）依賴性
　　既往已有研究報(bào)道，HIF-1α的穩(wěn)定性由RO

11、S所調(diào)控，而后者則可由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)抑制ROS產(chǎn)物可顯著降低FoxM1啟動(dòng)子的活性，而且BHA可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的HIF-1α和FoxM1表達(dá)。這些結(jié)果共同提示TNF-α誘導(dǎo)HIF-1α活性及FoxM1表達(dá)依賴于ROS。
　　6、TNF-α誘導(dǎo)FoxM1高表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡
　　為了研究TNF-α誘導(dǎo)表達(dá)的FoxM1在肝癌細(xì)胞惡性表型中的作用，我們用慢病毒感染HepG2細(xì)胞，構(gòu)建

12、了4株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，分別是LV-shcontrol、LV-shFoxM1、LV-control和LV-FoxM1。在TNF-α處理后，LV-shcontrol和LV-control亞細(xì)胞株的細(xì)胞活性近似，而LV-FoxM1亞細(xì)胞株的細(xì)胞存活率最高，LV-shFoxM1所得結(jié)果與之相反。生存分析顯示，F(xiàn)oxM1的表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的生長速度呈明顯正相關(guān)。接下來，我們還發(fā)現(xiàn)敲除FoxM1的亞細(xì)胞株其細(xì)胞克隆形成能力明顯弱于對照株細(xì)胞，而高

13、表達(dá)FoxM1則有相反作用。除此之外，我們還通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)下調(diào)FoxM1的表達(dá)能明顯引起肝癌細(xì)胞的凋亡，而上調(diào)其表達(dá)則出現(xiàn)相反的結(jié)果。Hochest染色的結(jié)果與之相似。進(jìn)一步用HIF-1α抑制劑YC-1或ROS抑制劑BHA處理細(xì)胞，F(xiàn)oxM1敲除亞細(xì)胞株的生長進(jìn)一步被抑制，凋亡被進(jìn)一步促進(jìn)，上調(diào)FoxM1表達(dá)則逆轉(zhuǎn)這些作用。這些結(jié)果證實(shí)TNF-α誘導(dǎo)FoxM1的表達(dá)對于肝細(xì)胞肝癌的生長具有重要的促進(jìn)作用，而且這個(gè)作用是通過ROS/

14、HIF-1α途徑的。
　　7、HIF-1α和FoxM1的共表達(dá)預(yù)示術(shù)后肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后不良。
　　免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，在406例肝細(xì)胞肝癌組織中HIF-1α和FoxM1具有明顯的表達(dá)正相關(guān)性（P=0.044）。HIF-1α高表達(dá)提示較差的預(yù)后，即更高的術(shù)后復(fù)發(fā)率和更短的生存期。進(jìn)一步分析，結(jié)合HIF-1α和FoxM1的表達(dá)水平，患者被分為4組，Kaplan-Meier統(tǒng)計(jì)分析顯示4個(gè)亞組之間患者的復(fù)發(fā)率和生存期具有較明顯的差

15、異，其中共表達(dá)HIF-1α和FoxM1的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率最高，生存期最短。再進(jìn)一步分析FoxM1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系顯示，無論HIF-1α是否表達(dá)，F(xiàn)oxM1陽性的患者相比陰性的患者復(fù)發(fā)率更高，生存期更短。綜上，HIF-1α和FoxM1的共表達(dá)預(yù)示肝細(xì)胞肝癌患者術(shù)后預(yù)后較差。
　　【結(jié)論】
　　1.率先發(fā)現(xiàn)TNF-α可以明顯上調(diào)肝癌細(xì)胞中FoxM1表達(dá)并增強(qiáng)其啟動(dòng)子活性，從而導(dǎo)致FoxM1靶基因cyclinB1、cyclinD1表

16、達(dá)上調(diào)。
　　2.分別通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、ChIP和siRNA干擾試驗(yàn)驗(yàn)證了TNF-α上調(diào)FoxM1表達(dá)是通過HIF-1α結(jié)合于FoxM1的啟動(dòng)子區(qū)，其中HIF1α-1和HIF1α-3/4結(jié)合位點(diǎn)至關(guān)重要。
　　3.證實(shí)了TNF-α誘導(dǎo)HIF-1α活性及FoxM1表達(dá)具有活性氧簇（ROS）依賴性。
　　4.進(jìn)一步通過FoxM1的正義表達(dá)和RNA干擾，HIF-1α的RNA干擾和化學(xué)抑制劑作用，ROS的化學(xué)抑制劑作