轉(zhuǎn)錄因子DEC1調(diào)控胃癌細胞增殖機制的研究.pdf

1、背景
　　 胃癌是全球常見的惡性腫瘤形式，其發(fā)生發(fā)展的分子機制一直是生命科學研究的熱點問題。腫瘤相關(guān)基因或特異基因表達水平的變化，多種信號轉(zhuǎn)導蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的激活均可導致腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。同時，轉(zhuǎn)錄因子對基因的表達調(diào)控作用是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，研究其在腫瘤中的具體表達調(diào)控模式，可能為腫瘤治療提供新的預測指標和干預靶點。
　　 DEC1(Differentiatedembryo-chondrocyteexpress

2、edgene)是一個生長發(fā)育基因，也是具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。以往關(guān)于DEC1的研究多集中于生物鐘調(diào)控、細胞分化及免疫應答。近年來發(fā)現(xiàn)它與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)，缺氧、血清饑餓、細胞因子、生長因子、感染等均可誘導腫瘤中DEC1信號通路的啟動，并且其調(diào)控的靶基因都是參與細胞增殖及凋亡的重要分子。但DEC1究竟是作為癌基因還是抑癌基因發(fā)揮作用充滿爭議。主要體現(xiàn)在:(1)DEC1在腫瘤中呈組織細胞特異性的表達模式，表達

3、的上調(diào)或下調(diào)與腫瘤類型密切相關(guān);(2)腫瘤中DEC1表達的臨床意義尚不統(tǒng)一;(3)DEC1對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響以及對抑癌基因和促癌基因的作用尚無定論。DEC1在腫瘤細胞中的這種雙重作用主要與DEC1及其上下游調(diào)控分子的時空分布及表達量密切相關(guān)。因而需要更加深入的研究不同腫瘤中DEC1的表達調(diào)控模式。雖然我們的前期研究已表明，DEC1基因在胃癌組織中呈高表達，但DEC1基因的表達在胃癌發(fā)生發(fā)展中究竟是發(fā)揮抑癌作用還是促癌作用及其具體

4、的機制尚不明確，這正是本研究擬解決的關(guān)鍵問題。
　　 目的
　　 1.檢測DEC1在胃癌組織中的表達，分析其表達水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以及與細胞增殖抗原Ki67表達的相關(guān)性，探討其潛在的臨床價值;
　　 2.建立DEC1慢病毒RNA干擾載體，獲得穩(wěn)定基因敲除的胃癌細胞，為研究DEC1表達調(diào)控作用提供良好的細胞模型;
　　 3.探討DEC1對胃癌細胞增殖的調(diào)控作用及其機制，為明確其是否可作為胃癌治療的

5、新靶點提供實驗依據(jù)。
　　 方法
　　 1.免疫組織化學染色法檢測173例胃癌組織及相應癌旁正常組織中DEC1的表達情況，分析DEC1表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系及其與Ki67表達的相關(guān)性。
　　 2.構(gòu)建包裝DEC1-shRNA慢病毒載體(pKL2099-DEC1shRNA)和陰性對照載體(pKL2099-NCshRNA);在293T細胞中進行病毒包裝和滴度測定;慢病毒載體感染胃癌細胞BGC823和MGC8

6、03細胞，篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株;RT-PCR及westernblot驗證慢病毒載體的有效性。
　　 3.采用CCK-8實驗、平板克隆形成實驗、流式細胞術(shù)觀察抑制DEC1表達對胃癌細胞體外增殖能力、克隆形成能力及細胞周期的影響。
　　 4.AnnexinV-PE/7-AAD雙染色法檢測細胞的凋亡;Hoechst33258染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學變化。
　　 5.Westernblot檢測細胞凋亡相關(guān)分子Survi

7、vin、p53及Caspase3的表達變化。
　　 結(jié)果
　　 1.DEC1在胃癌組織和癌旁正常組織中的陽性表達率分別為83.8％和23.7％(P＜0.05)，并且DEC1的表達與組織的分化程度負相關(guān)(P＜0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無關(guān)(P＞0.05);DEC1在胃癌組織中的表達與Ki67蛋白的表達正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.249，P＜0.05)。
　　 2.通過陽性克隆測序，證

8、實針對DEC1及陰性對照的載體分別構(gòu)建成功;兩個慢病毒載體pKL2099-DEC1shRNA、pKL2099-NCshRNA滴度分別為3E+9TU/ml和6E+9TU/ml;嘌呤霉素(puromycin)篩選得到的穩(wěn)定表達的細胞株BGC823-DEC1shRNA及MGC803-DEC1shRNA細胞中DEC1mRNA表達水平的抑制率分別為(88.24％±1.47％)和(79.34％±1.09％)，蛋白水平的抑制率為(75.43％±2.3

9、1％)和(69.36％±2.11)，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 3.穩(wěn)定抑制DEC1表達的BGC823-DEC1shRNA組細胞與陰性對照組BGC823-NCshRNA細胞相比，增殖率明顯下降(P＜0.05);平板克隆形成實驗證實BGC823-DEC1shRNA組細胞形成克隆的數(shù)量明顯低于BGC823-NCshRNA組細胞;流式細胞術(shù)測定細胞周期結(jié)果顯示BGC823-DEC1shRNA組細胞處于G0/G1細胞增多，而

10、S期與G2/M細胞減少，差異有顯著性(p＜0.05）。
　　 4.AnnexinV-PE/7-AAD雙染色法結(jié)果表明BGC823-DEC1shRNA組早期凋亡細胞比例高于陰性對照BGC823-NCshRNA(34.98％±1.05％vs5.95％±0.98)，差異有顯著性(p＜0.05)。慢病毒感染胃癌細胞7d后，在BGC823-DEC1shRNA組細胞中可以觀察到典型的核濃縮、核碎裂等細胞凋亡的形態(tài)學改變。
　　 5.

11、Westernblot結(jié)果提示，下調(diào)DEC1的表達后，細胞中的Survivin的表達下調(diào)，而p53、Caspase3表達上調(diào)。
　　 結(jié)論
　　 DEC1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，其表達水平隨腫瘤病理分級增高而顯著升高，并且與Ki67的表達正相關(guān)，說明DEC1的高表達與胃癌的惡性進程密切相關(guān);成功構(gòu)建了靶向DEC1的慢病毒RNAi表達載體，分別感染胃癌細胞BGC823和MGC803，經(jīng)嘌呤霉素(puromy