AlUp對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期調(diào)控的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是常見的人消化道癌癥，發(fā)病率在全部人類癌癥中占據(jù)第四位，同時(shí)，胃癌的致死率達(dá)到70％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他常見的人類癌癥。胃癌的高發(fā)病率與高致死率嚴(yán)重影響了人類健康和生活。近幾十年來(lái)，盡管新的診療技術(shù)不斷出現(xiàn)，但由于胃癌早期診斷困難，且容易轉(zhuǎn)移，故其手術(shù)根治效果較差，術(shù)前術(shù)后放化療效果亦不理想。分子生物學(xué)研究的不斷深入，為胃癌的基因治療提供了廣闊前景，近些年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越多地把目光投向癌癥的基因治療。因此，尋找可用于胃癌治療的靶基因?qū)ξ赴┑?/p>

2、治療具有重要價(jià)值。
　　A1Up（ataxin-1 interacting ubiquitin-like protein）即人共濟(jì)失調(diào)蛋白-1泛素樣互作蛋白，屬于Ubiquilins家族的。Ubiquilins可以通過(guò)將蛋白連接到蛋白酶體，增強(qiáng)自噬介導(dǎo)的退化和參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)的蛋白降解。但A1Up在腫瘤與正常組織中的表達(dá)情況及在其腫瘤細(xì)胞中的功能相關(guān)研究還未見報(bào)道。
　　在本研究中，我們對(duì)94對(duì)胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組化分

3、析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A1Up在胃正常組織中表達(dá)高于胃癌組織(p＜0.01)。隨后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)A1Up可抑制胃癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯、細(xì)胞衰老，以及抑制MKN45在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力。我們對(duì)過(guò)表達(dá)及敲降A(chǔ)1Up的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，篩選到874個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因450個(gè)，下調(diào)基因424個(gè)。為進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因的功能，我們進(jìn)行了GO分析和KEGG分析。結(jié)果顯示，A1Up很可能通過(guò)p53信號(hào)通路發(fā)

4、揮生物學(xué)作用。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了A1Up可以調(diào)控p53、p21的表達(dá)，并且二者的表達(dá)量與A1Up的表達(dá)量呈正相關(guān)。用化療藥物Camptothecin誘導(dǎo)MKN45細(xì)胞中p53的表達(dá)，A1Up也呈表達(dá)增高趨勢(shì)，并且A1Up表達(dá)升高和下降的趨勢(shì)均早于p53、p21。而A1Up對(duì)p21的表達(dá)量的影響，除依賴p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，還有其它的調(diào)控方式。用蛋白合成抑制劑放線菌酮CHX處理細(xì)胞，與對(duì)照組相比，MKN45/pLVX-

5、A1Up細(xì)胞中p21的降解速率明顯減慢。由此我們得出結(jié)論，A1Up可以抑制p21的泛素化降解，從而上調(diào)p21的表達(dá)水平。隨后我們對(duì)A1Up的相互作用蛋白進(jìn)行了富集，通過(guò)質(zhì)譜分析尋找到相互作用蛋白——RNF114，Co-IP也進(jìn)一步驗(yàn)證了RNF114與A1Up有相互作用。在MKN45和BGC-823細(xì)胞中進(jìn)行了A1Up的過(guò)表達(dá)和敲降，結(jié)果顯示RNF114與A1Up的表達(dá)量成反比。而RNF114作為p21的一個(gè)E3連接酶，能過(guò)RING結(jié)構(gòu)介

6、導(dǎo)p21的降解，所以A1Up很有可能通過(guò)介導(dǎo)RNF114的泛素化降解來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞中p21的表達(dá)。與胃癌細(xì)胞株MKN45、BGC823不同的是，A1Up可以誘導(dǎo)永生化胃粘膜細(xì)胞株GES-1發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染空載病毒及A1Up病毒的兩組細(xì)胞早期凋亡比例分別為3.4±1.1％和13.1±1.8％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。Western blot也檢測(cè)到了凋亡的執(zhí)行分子Caspase3、PARP的活化。更有趣的是，

7、我們分別將GES-1、MKN45、BGC823細(xì)胞同步化于G1/S、S、G2/M及M期，發(fā)現(xiàn)A1Up在M期發(fā)生了磷酸化修飾，并且該修飾依賴于激酶CDK1的活性。經(jīng)質(zhì)譜鑒定磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果顯示A1Up在G1期的磷酸化位點(diǎn)有19個(gè)，在M期有32個(gè)，其中僅在M期發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有22個(gè)。
　　綜上所述，我們對(duì)A1Up在胃癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，首次發(fā)現(xiàn)了A1Up通過(guò)調(diào)控p53信號(hào)通路及其下游基因，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的抑癌作用