pUL49調(diào)控HCMV宿主細(xì)胞周期和增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus。HCMV）作為皰疹病毒的β-亞族成員，在人群中感染非常普遍。HCMV感染對(duì)健康人一般不致病，但對(duì)免疫低下人群如新生兒、多次輸血、器官移植、艾滋病患者等會(huì)致病，甚至導(dǎo)致死亡。pUL49是 HCMV病毒編碼的蛋白，為病毒復(fù)制所必需，缺失 pUL49開(kāi)放閱讀框（ORF）的BAC-Towne-ΔUL49病毒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞不能包裝出子代病毒粒子。pUL49 mRNA的下調(diào)也會(huì)嚴(yán)重影響病毒的復(fù)

2、制。盡管pUL49非常重要，但其在宿主細(xì)胞中的功能及作用機(jī)理目前還不明確。本課題為探索 pUL49在宿主細(xì)胞中的功能，開(kāi)展了如下研究：
　　構(gòu)建pUL-49基因過(guò)表達(dá)的慢病毒載體，包裝、擴(kuò)增、純化病毒，感染U373細(xì)胞，篩選得到pUL49過(guò)表達(dá)的U373穩(wěn)定細(xì)胞系。我們首先發(fā)現(xiàn)在pUL49穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的U373細(xì)胞中細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pUL49過(guò)表達(dá)不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、不影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，但是使G1/S期細(xì)

3、胞數(shù)量增加，說(shuō)明pUL49過(guò)表達(dá)抑制U373細(xì)胞增殖不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G1/S期實(shí)現(xiàn)的。
　　為研究pUL49蛋白對(duì)U373細(xì)胞增殖抑制的分子機(jī)制，我們通過(guò)基于免疫共沉淀的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選得到33種與pUL49相互作用的宿主蛋白，其中一個(gè)侯選蛋白是FRK。FRK屬于非受體蛋白酪氨酸激酶的一種，結(jié)構(gòu)上與Src家族成員具有高度同源性；FRK具有磷酸化底物，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，阻滯細(xì)胞周期于G1期等作用。為

4、了進(jìn)一步確定二者之間的相互作用，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)確定pUL49和FRK在U373細(xì)胞中能夠相互作用、間接免疫熒光技術(shù)確定pUL49和FRK共定位于細(xì)胞核。
　　pUL49和 FRK相互作用，兩者又都抑制細(xì)胞增殖，提示 pUL49可能通過(guò)FRK調(diào)控U373宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)pUL49和FRK的siRNA，通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)組合發(fā)現(xiàn)pUL49過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞增殖；敲低FRK促進(jìn)細(xì)胞增殖；在pUL49過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中同時(shí)

5、敲低pUL49可以部分抵消pUL49過(guò)表達(dá)引起的增殖抑制；pUL49過(guò)表達(dá)的同時(shí)敲低FRK也能部分抵消pUL49過(guò)表達(dá)引起的增殖抑制，兩者趨勢(shì)一致；在 pUL49過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中同時(shí)敲低 FRK和pUL49，pUL49對(duì)增殖的抑制幾乎全部被抵消，證實(shí) pUL49可通過(guò) FRK調(diào)控U373宿主細(xì)胞的增殖。同樣以過(guò)表達(dá)和敲低實(shí)驗(yàn)組合發(fā)現(xiàn)pUL49通過(guò)FRK阻滯細(xì)胞周期于G1/S期。
　　FRK阻滯細(xì)胞周期的其中一個(gè)機(jī)制是抑制細(xì)胞周期蛋白

6、cyclin D1進(jìn)入細(xì)胞核。我們?cè)谶^(guò)表達(dá)pUL49的同時(shí)敲低FRK觀察cyclinD1蛋白在細(xì)胞核內(nèi)的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pUL49過(guò)表達(dá)不影響cyclin D1蛋白的表達(dá)，但會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的cyclin D1蛋白減少，細(xì)胞質(zhì)中的cyclin D1蛋白增加，但同時(shí)敲低FRK使細(xì)胞核內(nèi)的cyclin D1蛋白又會(huì)增加，相應(yīng)地細(xì)胞質(zhì)中的cyclin D1蛋白減少，說(shuō)明pUL49調(diào)控U373宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期是通過(guò)FRK調(diào)控cyclin D1

7、的入核實(shí)現(xiàn)的。
　　以高通量液相芯片技術(shù)檢測(cè)若干調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)pUL49過(guò)表達(dá)增加 IRS-1(S636/S639)和 P70S6K(T421/S424)蛋白的磷酸化。Western Blot進(jìn)一步確定pUL49使 IRS-1信號(hào)通路的IRS-1(S636/S639)、AKT(S473/T308)、PDK1(S241)、mTOR(S2448)、P70S6K(T421/S424)磷酸化。mTOR(S2448)、P7

8、0S6K(T421/S424)抑制劑均使細(xì)胞增殖進(jìn)一步受到抑制，說(shuō)明pUL49還需要通過(guò)IRS-1/AKT/mTOR/P70S6K信號(hào)通路來(lái)維持宿主細(xì)胞的生存。
　　實(shí)驗(yàn)室前期研究表明缺失N端143個(gè)氨基酸后，pUL49的核定位可被影響，因此我們構(gòu)建了pUL49及其缺失體pUL49(ΔN143)、pUL49(ΔN100)、pUL49(143)、pUL49(100)的真核表達(dá)載體。結(jié)果表明去除N端143個(gè)氨基酸后，pUL49(ΔN1

9、43)、pUL49(ΔN100)仍可使IRS-1(S636/S639)和P70S6K(T421/S424)磷酸化，證明pUL49蛋白的核定位對(duì)于IRS-1(S636/S639)和P70S6K(T421/S424)蛋白的磷酸化的調(diào)節(jié)不是必須的。
　　總之，通過(guò)本課題研究，我們揭示了pUL49作為HCMV病毒的必須基因，通過(guò)FRK促使宿主細(xì)胞U373的細(xì)胞周期阻滯于G1/S期，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，pUL49同時(shí)通過(guò)IRS-1/AK