人類LNX調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞周期的分子機(jī)制研究.pdf

1、LNX蛋白(Ligand of Numb-protein X)是最初作為發(fā)育過程中細(xì)胞命運(yùn)決定因子Numb的相互作用蛋白而被分離出來。隨后研究證實(shí)，LNX蛋白包括如下結(jié)構(gòu)：N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(RING finger domain)，LDNPAY基序，和C端的4個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域。它能作為RING finger類型的泛素連接酶，導(dǎo)致Numb蛋白的泛素化和降解。LNX蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的含有PDZ結(jié)構(gòu)域的RING finger家族E3泛素連接酶成

2、員。近年來的研究證實(shí)，LNX蛋白不僅參與信號(hào)傳導(dǎo)(比如Notch信號(hào)通路)，而且在腫瘤發(fā)生中扮演重要作用。但LNX發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍未完全闡明。
　　LNX包含4個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，這使得它在協(xié)調(diào)不同細(xì)胞信號(hào)組件方面發(fā)揮重要作用。之前已通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選可能與LNX相互作用的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)候選蛋白就是RhoC。RhoC蛋白是Ras家族成員之一，它促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重新組織，調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、附著和運(yùn)動(dòng)。我們通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)

3、果證實(shí)LNX能與RhoC相互作用，也證實(shí)LNX的第一個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域?qū)τ贚NX和RhoC的結(jié)合是不可缺少的。熒光共定位實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)與LNX共轉(zhuǎn)染時(shí)，RhoC蛋白改變其細(xì)胞亞定位，從全細(xì)胞定位改變?yōu)榧?xì)胞核定位。此外，我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LNX對(duì)AP-1轉(zhuǎn)錄活性有上調(diào)作用，而當(dāng)LNX和RhoC共轉(zhuǎn)染時(shí)，AP-1轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。我們推測LNX和RhoC是大型的蛋白復(fù)合物的組成部分，調(diào)節(jié)AP-1轉(zhuǎn)錄活性，也在信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。
　　

4、我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)siRNA介導(dǎo)的LNX基因表達(dá)抑制可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。為了進(jìn)一步解析LNX基因沉默后導(dǎo)致的細(xì)胞周期停滯的分子機(jī)制，我們應(yīng)用Illumina microarray技術(shù)分析了LNX表達(dá)抑制細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)全基因組mRNA表達(dá)譜的變化，并通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了近30條microarray實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞周期相關(guān)的差異表達(dá)的候選基因。結(jié)合在線的數(shù)據(jù)庫中關(guān)于相關(guān)基因功能、信號(hào)通路和細(xì)胞周期機(jī)制的信息，

5、詳細(xì)的分析了內(nèi)源性LNX影響細(xì)胞周期可能的作用模式和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　綜合所有結(jié)果，提示LNX表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的細(xì)胞周期G0/G1阻滯和LNX表達(dá)下調(diào)后導(dǎo)致的β-catenin、MAPK、c-Myc、NF-κB依賴性通路抑制和TGF-β、p53-依賴性通路激活有關(guān)。這項(xiàng)研究有助于全面的深入了解內(nèi)源性LNX蛋白對(duì)細(xì)胞周期的影響和調(diào)控作用：并且為研究LNX的多效性分子生物學(xué)功能(比如：腳手架功能和泛素連接酶功能)及在腫瘤發(fā)生中的作用提供了新