EGCG調(diào)節(jié)p53和EGFR信號通路抑制人類肺癌細(xì)胞的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　肺癌是人類腫瘤的頭號殺手，其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌患者五年生存率得不到有效改善的主要原因。腫瘤抑制基因的過度失活與癌基因的異?；罨诜伟┑陌l(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。超過60％的肺癌中出現(xiàn)了腫瘤抑制基因p53的突變與功能異常;超過25％的肺癌中檢測到了原癌基因c-erbB1(EGFR)的擴(kuò)增。近年來，腫瘤的化學(xué)預(yù)防日益受到人們的關(guān)注，綠茶多酚EGCG是目前已知的最有效的天然抗腫瘤化合物之一。雖然已有研究證實(shí)EGCG能活化p

2、53并能抑制EGFR信號通路，但其分子機(jī)制還不清楚。鑒于此，有必要對EGCG調(diào)節(jié)p53及EGFR信號通路抗肺腫瘤的分子機(jī)制作進(jìn)一步研究。
　　目的:
　　首先以p53的翻譯后修飾為切入點(diǎn)，通過分析p53蛋白的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄活性及其負(fù)性調(diào)節(jié)因子MDM2對p53的降解作用，為EGCG誘導(dǎo)p53蛋白活化的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。接著，以EGFR及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為靶標(biāo)，從EGFR激酶活性和轉(zhuǎn)錄活性入手，分析EGCG在多個(gè)層面對EG

3、FR信號通路抑制的分子機(jī)制，為EGCG的肺癌預(yù)防與潛在的臨床治療應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　首先，通過軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)和慢病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，確認(rèn)EGCG抗肺腫瘤的效果部分依賴于p53蛋白活性。接著，利用western blot、熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，從p53蛋白穩(wěn)定性，胞漿胞核分布及其反式激活能力等方面，證實(shí)EGCG誘導(dǎo)p53蛋白的積聚與活化。通過免疫共沉淀分析EGCG對MDM2與p53的結(jié)合能力及p

4、53泛素化降解的影響。Western blot分析EGCG對EGF誘導(dǎo)的EGFR信號通路活化的影響，檢測EGCG對EGFR總蛋白、胞膜、胞核表達(dá)的影響及其反式激活能力的改變，再應(yīng)用Western blot分析EGFR靶基因cyclinD1的表達(dá)。最后，流式細(xì)胞術(shù)分析EGCG對肺癌細(xì)胞周期行進(jìn)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.Soft agar結(jié)果表明，EGCG對p53野生型肺癌細(xì)胞具有更顯著的抑制效果，基因沉默p53表達(dá)能增強(qiáng)肺

5、癌細(xì)胞對EGCG的耐受能力。
　　2.Western blot結(jié)果顯示，EGCG延長p53和MDM2的半衰期，并劑量依賴性上調(diào)p53 Ser15和Ser20磷酸化及其下游靶基因MDM2和p21的表達(dá)，促進(jìn)p53的核積聚。
　　3.熒光素酶雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果提示，EGCG劑量依賴性上調(diào)p53的反式激活能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4.免疫沉淀分析表明，EGCG顯著抑制MDM2與p53的結(jié)合及MDM2介導(dǎo)的

6、p53泛素化降解。
　　5.EGCG劑量依賴性抑制EGF誘導(dǎo)的EGFR信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，如ERK1/2、AKT信號通路的活化及即刻早期基因c-Fos的表達(dá)。
　　6.Western blot結(jié)果顯示，EGCG劑量依賴性和時(shí)間依賴性抑制EGFR的總蛋白、胞膜和胞核表達(dá)，并抑制EGFR的下游靶基因cyclinD1的表達(dá)。
　　7.EGCG劑量依賴性抑制EGFR的反式激活能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　8.流

7、式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，EGCG劑量依賴性誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞周期阻滯與G0/G1期。
　　結(jié)論:
　　1.EGCG活化抑瘤蛋白p53信號通路促進(jìn)其抗肺腫瘤效果。EGCG通過上調(diào)p53的磷酸化，抑制MDM2與p53的相互作用從而抑制MDM2對p53的泛素化降解促進(jìn)p53的穩(wěn)定與積聚。EGCG通過促進(jìn)p53的胞核積聚，上調(diào)其反式激活能力，從而誘導(dǎo)其下游靶基因如p21等的表達(dá)上調(diào)，干擾肺癌細(xì)胞周期行進(jìn)。
　　2.EGCG滅活致瘤蛋白EG