Hedgehog信號(hào)通路在EGFR-TKI敏感和耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是全球死亡率最高的惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lungcancer, NSCLC)占所有肺癌病例的85％左右。以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合化療是晚期NSCLC的一線標(biāo)準(zhǔn)治療方案，其中位無(wú)進(jìn)展生存(progression free survival，PFS)僅有5個(gè)月左右[1]。分子靶向藥物的出現(xiàn)，為肺癌的治療帶來(lái)了很大的希望。對(duì)于上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，

2、EGFR)敏感突變患者，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）的有效率達(dá)71.2％，現(xiàn)已成為EGFR敏感突變型晚期NSCLC患者的一線用藥[2]。EGFR-TKI用于二線或三線治療時(shí)也優(yōu)于最佳支持治療[3]。但是幾乎所有的患者最終都不可避免的出現(xiàn)耐藥，EGFR-TKI原發(fā)耐藥或繼發(fā)耐藥的現(xiàn)象大大限制了其在臨床的應(yīng)用?，F(xiàn)已報(bào)導(dǎo)的與EGFR-TKI耐藥有關(guān)的機(jī)制包括T790

3、M二次突變[4，5]、MET擴(kuò)增[6，7]、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)過(guò)表達(dá)[8]以及KRAS突變[9,10]等。
　　 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是胚胎期的重要信號(hào)通路之一，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)以及干細(xì)胞維持，以使組織器官正常發(fā)育。Hh信號(hào)通路在成人組織中的異常激活與多種腫瘤的形

4、成、自我更新及耐藥有關(guān)，這其中包括肺癌。不斷有證據(jù)表明惡性腫瘤中EMT可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移侵襲能力增加，并對(duì)傳統(tǒng)的治療方法產(chǎn)生耐藥[11，12]。癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancer stem-like cell，CSC)是另外一個(gè)導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)耐藥的原因[13]。最近有研究顯示腫瘤在EMT誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量CSC[14]。而Hh信號(hào)通路通過(guò)其下游的直接靶基因Snail及ABCG2等對(duì)腫瘤中的EMT過(guò)程及CSC進(jìn)行著緊密調(diào)節(jié)?，F(xiàn)已有多個(gè)Hh信號(hào)通

5、路抑制劑進(jìn)入Ⅰ期和Ⅱ期的臨床試驗(yàn)，并在皮膚基底細(xì)胞癌的治療中取得了良好的結(jié)果。在胚胎期，Hh信號(hào)通路和EGFR信號(hào)通路在腦干細(xì)胞的增殖過(guò)程中具有協(xié)同作用。因此我們推測(cè)，在NSCLC中，Hh信號(hào)通路的異常激活有可能代償性減弱了EGFR-TKI的治療效果。Hh信號(hào)通路抑制劑與EGFR-TKI的聯(lián)合應(yīng)用或許可以有效提高原發(fā)或繼發(fā)耐藥患者對(duì)EGFR-TKI的反應(yīng)性。
　　 本課題以具有EGFR-TKI敏感突變、繼發(fā)耐藥突變和原發(fā)耐藥突變

6、的NSCLC細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停到y(tǒng)檢測(cè)了EGFR-TKI敏感、繼發(fā)耐藥及原發(fā)耐藥NSCLC中Hh信號(hào)通路的活性差異，論證了Hh信號(hào)通路對(duì)EGFR-TKI敏感性的影響，并對(duì)Hh抑制劑和EGFR-TKI聯(lián)合用藥的效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　 第一章Hedgehog信號(hào)通路在非小細(xì)胞肺癌癌與癌旁組織表達(dá)差異
　　 方法：
　　 首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)20對(duì)配對(duì)的NSCLC腫瘤組織和癌旁組織中的Hh信號(hào)通路分子

7、PTCH1、PTCH2、SMO、GLI1、GLI2及GLI3的表達(dá)差異進(jìn)行比較。
　　 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢。因所有分子的表達(dá)均符合正態(tài)分布及方差齊，兩組間差異的比較用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)或兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異的比較用one-wayANOVA，各組間兩兩比較采用LSD法。兩組數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析如為正態(tài)分布者采用Pearson相關(guān)，如不符合正態(tài)分布者用spea

8、rman相關(guān)進(jìn)行分析。對(duì)不同組間生存差異的比較采用Kaplan-Meier生存分析以及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、患者的臨床病理學(xué)特征:本次研究是一個(gè)小樣本的初步研究，共有20對(duì)患者的癌與癌旁組織的配對(duì)樣本。所有患者全部為病理學(xué)證實(shí)的肺腺癌。早期（Ⅰ-Ⅱ期）和晚期（Ⅲ-Ⅳ期）患者各10例。有6例經(jīng)直接測(cè)序法證實(shí)為EGFR突變，2例為KRAS突變，5例為野生型

9、，另外有7例基因狀態(tài)未檢測(cè)。
　　 2、Hh信號(hào)通路分子在肺腺癌中的表達(dá)均較正常肺組織低。正態(tài)性檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，各分子的表達(dá)均符合正態(tài)分布，用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)對(duì)癌與癌旁組織的表達(dá)差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SMO在癌與癌旁組織中的表達(dá)差異無(wú)顯著性(t=-0.689,P=0.499),PTCH1(t=-7.764,P＜0.001)、PTCH2(t=-2.806,P=0.011)、GLI1(t=-3.725,P=0.001)、GLI2(t=

10、-4.648,P＜0.001)及GLI3(t=-8.124,P＜0.001)在癌與癌旁肺組織的表達(dá)有顯著性差異，均為癌旁組織較癌組織的表達(dá)高。
　　 3、僅少數(shù)肺腺癌中有Hh信號(hào)通路的異常激活。GLI1的過(guò)表達(dá)是比較公認(rèn)的Hh信號(hào)通路激活的標(biāo)志。我們的分析顯示僅有1例標(biāo)本(5％)的GLI1表達(dá)水平在腫瘤組織較癌旁組織上調(diào)2倍以上。這是1例有EGFR突變的早期肺癌患者。此外還有4例標(biāo)本(20％)的SMO表達(dá)水平在腫瘤組織較癌旁組織

11、上調(diào)2倍以上，這4例患者中，2例為早期患者，其中1例有EGFR突變，另一例基因狀況未知;2例為晚期患者，基因狀態(tài)均為EGFR野生型。這4例標(biāo)本中有1例早期病例同時(shí)有GLI2的上調(diào)，EGFR基因狀態(tài)未知;有1例晚期病例同時(shí)有PTCH2的上調(diào)，基因狀態(tài)為EGFR野生型。
　　 4、腫瘤組織中Hh信號(hào)通路基因表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系
　　 (1)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示腫瘤組織中GLI2表達(dá)水平在早期和晚期肺癌中有顯著差異（t=2.57

12、9，P=0.019），在早期肺癌中的表達(dá)較晚期肺癌高。其它基因表達(dá)水平在不同性別、吸煙與否、不同分期及不同基因狀態(tài)中均無(wú)顯著性差異。GLI1和GLI3表達(dá)水平在早期和晚期肺癌比較的P值分別為0.114和0.164，雖然由于樣本量較小，差異性不顯著，但是GLI1和GLI2有在早期肺癌較晚期肺癌表達(dá)高的趨勢(shì)。此外，在不同基因狀態(tài)下各分子表達(dá)水平差異的比較中，GLI1的P值為0.132，我們用LSD法對(duì)各組間GLI1的表達(dá)差異進(jìn)行兩兩比較，結(jié)

13、果發(fā)現(xiàn)野生型與EGFR突變型無(wú)顯著性差異（P=0.206）;野生型與KRAS突變型也無(wú)顯著性差異（P=0.297）;但EGFR突變型vs KRAS突變型，差異有邊緣統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.059），GLI1在KRAS突變型肺癌中的表達(dá)水平較EGFR突變型的表達(dá)水平高。因?yàn)槟挲g和腫瘤體積不符合正態(tài)分布，我們用spearman秩相關(guān)進(jìn)行分析的結(jié)果顯示各基因表達(dá)水平與年齡無(wú)相關(guān)性，SMO表達(dá)與腫瘤體積呈正相關(guān)（r=0.560，P=0.010）。<

14、br>　　 (2)我們以Hh信號(hào)通路基因在癌組織中表達(dá)的中位數(shù)為截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃楦弑磉_(dá)和低表達(dá)組，每組各有10例患者，行Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。結(jié)果顯示GLI1和GLI3高表達(dá)組患者的總生存均顯著較低表達(dá)組高。因?yàn)镚LI1高表達(dá)組的10例患者中有7例存活，因此未達(dá)到中位生存時(shí)間，低表達(dá)組中位生存時(shí)間為306天(Log-rank test，x2=3.957，P=0.047，95％CI:130.9-481

15、.1);GLI3高表達(dá)組的10例患者中也有7例存活，因此未達(dá)到中位生存時(shí)間，低表達(dá)組中位生存時(shí)間為306天(Log-rank test，x2=4.003，P=0.045，95％CI:0-794.1)。
　　 結(jié)論：
　　 總體上Hh信號(hào)通路分子在肺腺癌組織中的表達(dá)較正常肺組織低;Hh信號(hào)通路僅在少數(shù)肺腺癌中有異常激活。
　　 第二章EGFR-TKI敏感與耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中Hh信號(hào)通路的活性差異
　　

16、方法：
　　 用細(xì)胞免疫化學(xué)法、組織免疫化學(xué)法及Western blot的方法，檢測(cè)EGFR-TKI敏感突變、繼發(fā)耐藥突變及原發(fā)耐藥突變的細(xì)胞及組織中Hh信號(hào)通路活性。
　　 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢驗(yàn)。Western blot灰度分析的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。方差齊者，各組間蛋白表達(dá)的差異用one-way ANOVA，各組間兩兩比較用LSD法;方差不齊者

17、各組間蛋白表達(dá)的差異用近似F檢驗(yàn)welch法，各組間兩兩比較采用Dunnett's T3法。多組間等級(jí)資料的比較使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，等級(jí)資料的相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)分析。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中異常激活
　　 如前所述，GLI1表達(dá)通常被認(rèn)為是Hh信號(hào)通路激活與否的標(biāo)志。首先用細(xì)胞免疫組化法

18、檢測(cè)了GLI1在EGFR-TKI敏感和耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及定位。結(jié)果顯示在EGFR-TKI高度敏感細(xì)胞系PC9中，GLI1的表達(dá)是陰性的。但是在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975中GLI1表達(dá)陽(yáng)性。GLI1在A549和H1975的細(xì)胞核表達(dá)陽(yáng)性，提示Hh信號(hào)通路在這兩個(gè)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞系中高度激活，但是在EGFR-TKI敏感細(xì)胞系PC9中則處于沉默狀態(tài)。
　　 Westem blot再次驗(yàn)證了GLI1在EGFR

19、-TKI耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549和H1975中的表達(dá)水平顯著較EGFR-TKI敏感細(xì)胞PC9高。進(jìn)一步證明了Hh信號(hào)通路在EGFR-TKI敏感和耐藥細(xì)胞中的活性存在明顯差異，與EGFR-TKI敏感細(xì)胞相比，Hh信號(hào)通路在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中高度激活。
　　 2、EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中Hh信號(hào)通路的高度激活伴隨EMT表型和ABCG2的上調(diào)
　　 E-cadherin表達(dá)下調(diào)或丟失是EMT的標(biāo)志[15]。以前的研究顯示H

20、h信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)Snail而使E-cadherin的表達(dá)下調(diào)來(lái)調(diào)節(jié)EMT表型。此外干細(xì)胞標(biāo)志蛋白ABCG2也是Hh信號(hào)通路的直接靶基因[16]。為了進(jìn)一步闡明Hh信號(hào)通路在EGFR-TKI敏感和耐藥細(xì)胞中的差異，我們用western blot的方法對(duì)Hh信號(hào)通路的這幾個(gè)靶基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示與EGFR-TKI耐藥細(xì)胞A549和H1975的表達(dá)相比，在EGFR-TKI敏感細(xì)胞PC9中Snail的表達(dá)顯著下調(diào)，E-cadhefi

21、n的表達(dá)則顯著上調(diào)，而在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞A549和H1975中幾乎看不到表達(dá)。ABCG2的表達(dá)在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞A549和H1975中上調(diào)，尤以在A549細(xì)胞中上調(diào)最為明顯，這與GLI1在各細(xì)胞系中的表達(dá)趨勢(shì)相同。這些結(jié)果表明Hh信號(hào)通路在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中的異常激活同時(shí)伴有EMT表型的出現(xiàn)和ABCG2的上調(diào)。
　　 3、EGFR-TKI敏感和耐藥NSCLC組織標(biāo)本中的Hh信號(hào)通路活性
　　 為進(jìn)

22、一步了解在EGFR-TKI敏感和耐藥的NSCLC組織中Hh信號(hào)通路活性是否存在差異，我們選取了與PC9（EGFR敏感突變）、H1975(EGFR T790M繼發(fā)耐藥突變)和A549（KRAS突變）基因狀態(tài)相對(duì)應(yīng)的NSCLC腫瘤組織各4例，用免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC）檢測(cè)了GLI1、ABCG2、E-cadherin和Snail的表達(dá)?；驙顟B(tài)為EGFR19外顯子缺失或21外顯子L858R突變者，對(duì)E

23、GFR-TKI敏感;基因狀態(tài)為EGFR20外顯子T790M突變者，對(duì)EGFR-TKI繼發(fā)耐藥（即在EGFR-TKI用藥后產(chǎn)生的耐藥）;基因狀態(tài)為KRAS突變者，對(duì)EGFR-TKI原發(fā)耐藥。
　　 在EGFR-TKI敏感和耐藥突變的腫瘤組織中均可有GLI1的表達(dá)，由于樣本量小，Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)的結(jié)果顯示GLI1在各組間的表達(dá)無(wú)顯著性差異(x2=4.460，P=0.108)。但是GLI1的表達(dá)在EGFR-TKI敏

24、感突變組織中的平均秩次為5.25，在繼發(fā)耐藥組織中的平均秩次為4.88，而在KRAS突變的原發(fā)耐藥組織中的平均秩次為9.38，GLI1有在KRAS突變的原發(fā)耐藥組織中表達(dá)更高的趨勢(shì)，在KRAS突變組織中可能有更高的Hh信號(hào)通路活性。
　　 ABCG2表達(dá)在EGFR-TKI敏感突變組織中的平均秩次為5.13，在繼發(fā)耐藥組織中的平均秩次為6.00，在原發(fā)耐藥組織中的平均秩次為8.38，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=2.155，P=0.34

25、0)。E-cadherin表達(dá)在EGFR-TKI敏感突變組織中的平均秩次為8.00，在繼發(fā)耐藥組織中的平均秩次為5.75，在原發(fā)耐藥組織中的平均秩次為5.75，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.179，P=0.555)。Snail表達(dá)在EGFR-TKI敏感突變組織中的平均秩次為5.38，在繼發(fā)耐藥組織中的平均秩次為6.75，在原發(fā)耐藥組織中的平均秩次為7.38，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.838，P=0.658)。
　　 相關(guān)性分析的

26、結(jié)果顯示E-cadherin與Snail表達(dá)成顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.582，P=0.047)，這與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。此外，GLI1與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.408,P=0.188)，與Snail(r=0.327,P=0.300)和ABCG2(r=0.386,P=0.215)表達(dá)呈正相關(guān)，雖然由于樣本量少，相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但趨勢(shì)與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。
　　 結(jié)論“
　　 1、Hh信號(hào)通路活性在EG

27、FR-TKI敏感和耐藥細(xì)胞中存在顯著差異，在敏感細(xì)胞中處于沉默狀態(tài)，在原發(fā)和繼發(fā)耐藥細(xì)胞中異常激活。
　　 2、在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路的異常激活同時(shí)伴有EMT表型和ABCG2上調(diào)。
　　 3、在部分繼發(fā)或原發(fā)耐藥的NSCLC中有Hh信號(hào)通路的異常激活。Hh信號(hào)通路在KRAS突變的原發(fā)耐藥中可能有更重要的作用。
　　 第三章Hedgehog信號(hào)通路上調(diào)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EGFR-TKI敏感性的影

28、響
　　 方法：
　　 用外源性SHH刺激EGFR-TKI敏感細(xì)胞PC9后0h、24h、48h檢測(cè)其Hh信號(hào)通路活性，并用MTT法檢測(cè)Hh信號(hào)通路活性上調(diào)后Gefitinib對(duì)PC9細(xì)胞增殖的影響。
　　 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢驗(yàn)。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)均滿(mǎn)足正態(tài)分布，并方差齊，不同組間細(xì)胞增殖差異的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，各組間兩兩比較

29、采用LSD法。Western blot灰度分析的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布。方差齊者，各組間蛋白表達(dá)的差異用one-way ANOVA，各組間兩兩比較用LSD法;方差不齊者各組間蛋白表達(dá)的差異用近似F檢驗(yàn)welch法，各組間兩兩比較采用Dunnett's T3法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、外源性SHH暴露使EGFR-TKI敏感細(xì)胞PC9中的Hh信號(hào)通路活性上調(diào)
　　 上一章的結(jié)果顯示在PC9細(xì)

30、胞中Hh信號(hào)通路處于沉默狀態(tài)。因此我們用外源性的SHH細(xì)胞因子對(duì)PC9進(jìn)行處理（N-SHH0.5ug/ml）后，在0h、24h、48h細(xì)胞免疫組化法和western blot對(duì)Hh信號(hào)通路活性進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞免疫組化及Western blot的結(jié)果均顯示，在經(jīng)過(guò)外源性N-SHH處理24h和48h之后GLI1的表達(dá)顯著上調(diào)，Hh信號(hào)通路的活性顯著增高。
　　 2、Hh信號(hào)通路的上調(diào)使EGFR-TKI敏感細(xì)胞出現(xiàn)EMT表型并有ABCG

31、2的上調(diào)
　　 為了了解Hh信號(hào)通路的激活是否可以導(dǎo)致EMT表型的出現(xiàn)以及ABCG2的上調(diào)，我們用western blot檢測(cè)了經(jīng)外源性SHH處理后0h、24h、48h后E-cadherin、Snail和ABCG2的表達(dá)。結(jié)果顯示E-cadherin在外源性N-SHH處理24h和48h后顯著下調(diào)，而Snail的表達(dá)則逐漸上調(diào)。ABCG2的表達(dá)也在外源性N-SHH處理24h和48h后出現(xiàn)顯著上調(diào)。這說(shuō)明NSCLC細(xì)胞中Hh信號(hào)通路

32、異常激活可使細(xì)胞產(chǎn)生EMT表型，并使ABCG2的上調(diào)。
　　 3、Hh信號(hào)通路上調(diào)導(dǎo)致EGFR-TKI敏感細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI敏感性下降
　　 經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)證明外源性的SHH可使EGFR-TKI敏感細(xì)胞中的Hh信號(hào)通路活性在24h后出現(xiàn)上調(diào)。因此我們先將EGFR-TKI敏感細(xì)胞PC9暴露在N-SHH(0.5ug/ml)24h后再用EGFR-TKI吉非替尼進(jìn)行處理，然后再用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組（外源性

33、N-SHH暴露組）和對(duì)照組（未暴露組）間的細(xì)胞增殖有顯著差異（F=76.677，P＜0.001），不同Gefitinib劑量組間的細(xì)胞增殖也有顯著差異（F=32.785，P＜0.001）。在低劑量組（Gefitinib20nM），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖差異有邊緣統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.700，P=0.054），處理組的細(xì)胞增殖較對(duì)照組的細(xì)胞增殖高。在中劑量組(Gefitinib40nM)和高劑量組（Gefitinib80nM），實(shí)驗(yàn)組的

34、細(xì)胞增殖率均顯著較對(duì)照組高（中劑量組和高劑量組t值和P值分為為t=-8.146，P=0.001和t=-6.855，P=0.002），這些結(jié)果證明Hh信號(hào)通路異常激活可導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生耐受。
　　 結(jié)論：
　　 Hh信號(hào)通路異?；罨烧T導(dǎo)NSCLC細(xì)胞出現(xiàn)EMT表型，并使ABCG2表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI耐受。
　　 第四章Hh信號(hào)通路抑制劑與EGFR-TKI聯(lián)合應(yīng)

35、用對(duì)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞增殖能力的影響
　　 方法：
　　 用western blot檢測(cè)用Hedgehog信號(hào)通路抑制劑SANT-1處理后，EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中Hh信號(hào)通路活性，及ABCG2、EMT表型的變化。用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTT法檢測(cè)Gefitinib單藥、Hh信號(hào)通路抑制劑SANT-1單藥、或兩藥聯(lián)用對(duì)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞增殖的影響。
　　 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用

36、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)及方差齊性檢驗(yàn)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)均滿(mǎn)足正態(tài)分布，并方差齊，不同用藥處理對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響用one-way ANOVA。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的所有數(shù)據(jù)均滿(mǎn)足正態(tài)分布，并方差齊，不同組間細(xì)胞增殖差異的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，各組間兩兩比較采用LSD法。Western blot灰度分析的數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，方差齊者，各組間蛋白表達(dá)的差異用one-way ANOVA，各組間兩兩比較用LSD法;方差不齊者各

37、組間蛋白表達(dá)的差異用近似F檢驗(yàn)welch法，各組間兩兩比較采用Dunnett's T3法。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1\在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路的抑制可反轉(zhuǎn)EMT表型，下調(diào)ABCG2的表達(dá)，并抑制細(xì)胞的遷移能力。
　　 經(jīng)過(guò)SANT-1處理24h后，A549和H1975這兩個(gè)細(xì)胞系中的GLI1水平均明顯下調(diào)，Snail的表達(dá)在兩個(gè)細(xì)胞系中也顯著減弱了。在SANT-1處理后

38、48h，Snail在H1975中的表達(dá)幾乎看不到。與Snail的表達(dá)相反的是，在經(jīng)SANT-1處理后48h，在兩個(gè)細(xì)胞系中E-cadherin的表達(dá)均上調(diào)。在經(jīng)SANT-1處理后24h，在兩個(gè)細(xì)胞系中，ABCG2的表達(dá)也均顯著下調(diào)。這些結(jié)果表明在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路的抑制可顯著反轉(zhuǎn)EMT表型，并上調(diào)ABCG2的表達(dá)。劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示經(jīng)SANT-1處理48h后，EGFR-TKI耐藥細(xì)胞的遷移能力顯著減弱。
　

39、　 2、在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路抑制劑與EGFR-TKI的聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制細(xì)胞克隆形成能力
　　 在上面的研究中，我們證明了Hh信號(hào)通路抑制劑可以顯著反轉(zhuǎn)EMT表型，下調(diào)ABCG2表達(dá)，那么它是否可以通過(guò)這個(gè)機(jī)制來(lái)增加EGFR-TKI耐藥細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性呢？首先我們用細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)Gefitinib單藥、SANT-1單藥、以及兩藥聯(lián)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示在A549細(xì)胞系中，各組間

40、克隆形成能力差異性顯著（F=63.129，P＜0.001）。經(jīng)兩兩比較，結(jié)果顯示無(wú)論是Gefitinib單獨(dú)應(yīng)用（P=0.120），還是SANT-1單獨(dú)應(yīng)用（P=0.169）均不能有效抑制細(xì)胞的克隆形成能力;但是在兩藥聯(lián)合應(yīng)用組，克隆形成能力與對(duì)照組(P＜0.001)、Gefitinib單藥組(P＜0.001)及SANT-1單藥組(P＜0.001)相比，差異均有顯著性，兩藥聯(lián)用可顯著抑制細(xì)胞的克隆形成能力。在H1975細(xì)胞中，各組間克隆

41、形成能力也有顯著差異(F=23.114，P＜0.001)。經(jīng)兩兩比較結(jié)果顯示Gefitinib單藥組與對(duì)照組相比，克隆形成能力無(wú)顯著性差異（P=0.069）;SANT-1單藥組的克隆形成能力與對(duì)照組相比差異性顯著（P=0.003）。兩藥聯(lián)合組與對(duì)照組(P＜0.001)、Gefitinib單藥組(P＜0.001)和SANT-1單藥組（P=0.006）相比，克隆形成能力有顯著差異。這些結(jié)果表明Gefitinib和SANT-1的聯(lián)合應(yīng)用可以有

42、效的抑制EGFR-TKI耐藥細(xì)胞A549和H1975的克隆形成能力。
　　 3、Hh信號(hào)通路抑制劑與EGFR-TKI的聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制EGFR-TKI耐藥細(xì)胞的增殖
　　 以上克隆實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示我們Hh信號(hào)通路抑制劑與EGFR-TKI的聯(lián)合應(yīng)用有很強(qiáng)的協(xié)同。為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)結(jié)果，我們用MTT法檢測(cè)Gefitinib單獨(dú)應(yīng)用、SANT-1單獨(dú)應(yīng)用、或者兩藥的聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞增殖的影響。研究結(jié)果顯示在A549細(xì)胞中，Gef

43、itinib單藥組、SANT-1單藥組及兩藥聯(lián)用組的細(xì)胞增殖率存在顯著性差異（F=274.953，P＜0.001）。兩兩比較的結(jié)果顯示，Gefitinib單藥和SANT-1單藥相比對(duì)細(xì)胞增殖的影響無(wú)顯著性差異(P=0.689)，A549不但對(duì)Gefitinib耐藥，而且對(duì)SANT-1也耐藥。這與克隆形成實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。但是兩藥聯(lián)用組與Gefitinib單藥或SANT-1單藥相比，可顯著抑制細(xì)胞增殖(Gefitinib+SANT-1

44、vs Gfitinib單藥P＜0.001; Gefitinib+SANT-1 vs SANT-1單藥P＜0.001)。在低劑量組(Gefitinib20nM，SANT-120uM)，Gefitinib單藥、SANT-1單藥及兩藥聯(lián)用對(duì)細(xì)胞增殖影響的差異無(wú)顯著性（F=0.503，P=0.628）;在中劑量組(Gefitinib40nM，SANT-140uM)三組間細(xì)胞增殖有顯著性差異（F=77.787，P＜0.001），兩兩比較的結(jié)果顯示

45、Gefitinib單藥對(duì)SANT-1單藥差異無(wú)顯著性(P=0.891)，但兩藥聯(lián)用與Gefitinib單藥或SANT-1單藥相比，可顯著抑制細(xì)胞增殖（Gefitinib+SANT-1 vs Gfitinib單藥P＜0.001;Gefitinib+SANT-1 vsSANT-1單藥P＜0.001）;在高劑量組(Gefitinib80nM，SANT-180uM)三組間差異性顯著(F=303.919，P＜0.001)，兩兩比較的結(jié)果顯示Gef

46、itinib單藥對(duì)SANT-1單藥差異無(wú)顯著性（P=0.459），但兩藥聯(lián)用與Gefitinib單藥或SANT-1單藥相比，可顯著抑制細(xì)胞的增殖（Gefitinib+SANT-1 vs Gfitinib單藥P＜0.001;Gefitinib+SANT-1 vs SANT-1單藥P＜0.001）。
　　 在H1975中，Gefitinib單藥組、SANT-1單藥組及兩藥聯(lián)用組的細(xì)胞增殖存在顯著性差異（F=638.881，P＜0.0

47、01）。兩兩比較的結(jié)果顯示SANT-1較Gefitinib可顯著抑制細(xì)胞的增殖(P＜0.001);兩藥聯(lián)用與Gefitinib單藥和SANT-1單藥相比，亦可顯著抑制細(xì)胞的增殖（Gefitinib+SANT-1 vs Gfitinib單藥P＜0.001;Gefitinib+SANT-1 vs SANT-1單藥P＜0.001）。在低劑量組(Gefitinib20nM，SANT-120uM)，Gefitinib單藥、SANT-1單藥及兩藥聯(lián)

48、用對(duì)細(xì)胞增殖影響有顯著性差異（F=98.107，P＜0.001）兩兩比較的結(jié)果顯示SANT-1單藥與Gefitinib單藥相比差異性顯著（P＜0.001），兩藥聯(lián)用與Gefitinib單藥相比差異也有顯著性意義(P＜0.001);但兩藥聯(lián)用與SANT-1單藥相比差異無(wú)顯著性意義(P=0.154);在中劑量組(Gefitinib40nM，SANT-140uM)三組間差異有顯著性(F=154.647，P＜0.001)，兩兩比較的結(jié)果顯示Ge

49、fitinib單藥對(duì)SANT-1單藥差異性顯著（P＜0.001），兩藥聯(lián)用與Gefitinib單藥或SANT-1單藥相比，對(duì)可顯著抑制細(xì)胞的增殖（Gefitinib+SANT-1 vs Gfitinib單藥P＜0.001;Gefitinib+SANT-1 vsSANT-1單藥P=0.006）;在高劑量組（Gefitinib80nM，SANT-180uM）三組間差異性顯著（F=488.201，P＜0.001），兩兩比較的結(jié)果顯示Gefit

50、inib單藥對(duì)SANT-1單藥差異性顯著（P＜0.001），兩藥聯(lián)用與Gefitinib單藥或SANT-1單藥相比，也可顯著抑制細(xì)胞的增殖（Gefitinib+SANT-1 vs Gfitinib單藥P＜0.001; Gefitinib+SANT-1 vs SANT-1單藥P＜0.001）。
　　 結(jié)論：
　　 阻斷Hh信號(hào)通路活性可下調(diào)ABCG2表達(dá)，逆轉(zhuǎn)其EMT表型，并顯著抑制NSCLC細(xì)胞的遷移能力。Hh信號(hào)通路抑

51、制劑與EGFR-TKI聯(lián)用可協(xié)同性增加NSCLC對(duì)EGFR-TKI的敏感性，有效減少EGFR-TKI耐藥細(xì)胞的增殖能力。
　　 全文結(jié)論
　　 本文以PC9細(xì)胞（EGFR19外顯子缺失突變）、H1975細(xì)胞（EGFR20外顯子T790M繼發(fā)耐藥突變）和A549細(xì)胞（KRAS突變）作為細(xì)胞模型，系統(tǒng)比較了EGFR-TKI敏感或耐藥NSCLC細(xì)胞中Hh信號(hào)通路的活性差異。結(jié)果顯示，在PC9細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路處于沉默狀態(tài)，而

52、在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞H1975和A549中，Hh信號(hào)通路高度活化，并伴有EMT表型和ABCG2的上調(diào)。在與這三個(gè)細(xì)胞模型基因狀態(tài)相對(duì)應(yīng)的NSCLC組織中的檢測(cè)結(jié)果顯示，在部分EGFR-TKI繼發(fā)耐藥和原發(fā)耐藥的NSCLC組織中有Hh信號(hào)通路的異常激活，尤其是在KRAS突變的組織中，顯示出更高的Hh信號(hào)通路活性。
　　 用外源性SHH處理PC9細(xì)胞，使PC9細(xì)胞中的Hh信號(hào)通路活化，可發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路活化使PC9中的ABCG

53、2的表達(dá)顯著上調(diào)并有EMT表型出現(xiàn)，并且使PC9細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生耐受。用Hh信號(hào)通路抑制劑對(duì)EGFR-TKI耐藥細(xì)胞中的Hh信號(hào)通路阻斷，可下調(diào)ABCG2表達(dá)、反轉(zhuǎn)EMT表型，并抑制細(xì)胞的遷移能力。與Hh或EGFR-TKI單藥相比，Hh抑制劑與EGFR-TKI聯(lián)用，可顯著抑制EGFR-TKI耐藥細(xì)胞的克隆形成和增殖能力，顯示出良好的協(xié)同作用。
　　 在NSCLC細(xì)胞中，Hh信號(hào)通路的異?；罨瑢?dǎo)致ABCG2上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)