非小細胞肺癌細胞中Nrf2信號通路抑制作用的研究.pdf

1、Nrf2-ARE信號通路在腫瘤化學(xué)預(yù)防和腫瘤耐藥性兩方面起著重要作用，Nrf2在細胞核中的累積可以導(dǎo)致腫瘤細胞獲得耐藥性，而且現(xiàn)已成為增敏腫瘤細胞的有效藥靶。本研究主要分為3個部分。
　　 第一部分：通過構(gòu)建Keap1高表達的穩(wěn)定細胞株，探討Keap1對Nrf2信號通路的影響。我們將野生型mKeap1-pEGFP轉(zhuǎn)染非小細胞肺癌細胞A549和H460，通過Western blot、免疫細胞化學(xué)、PCR篩選得到Keap1穩(wěn)定表達的

2、細胞株A549-mKeap1-pEGFP（H1）和H460-mKeap1-pEGFP（N5），同時轉(zhuǎn)染pEGFP建立對照組細胞株。與對照組相比，Keap1高表達的細胞株中Nrf2與其調(diào)控蛋白質(zhì)的表達均有降低。MTS法分析數(shù)據(jù)顯示，與對照組細胞株相比，H1對抗癌藥物奧沙利鉑更敏感，在H460-N5細胞株中，抗癌藥物奧沙利鉑、阿霉素和依托泊苷的增敏作用明顯增強?？梢姡琄eap1過表達后，降低了Nrf2及其調(diào)控基因的表達，增敏非小細胞肺癌細胞

3、對抗腫瘤藥物的作用。
　　 第二部分：利用細胞核亞細胞器結(jié)構(gòu)的一些特異性蛋白質(zhì)： Coilin、SMN、SC35、核孔復(fù)合體（nuclear pore complex，NPC）、RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）及Y12等標記亞細胞器，研究Nrf2小分子抑制劑貝沙羅汀（Bexarotene）對Nrf2轉(zhuǎn)錄活性影響的機制，同時對Nrf2在細胞中的定位進行了探討。激光共聚焦顯微鏡顯示，A549細胞中Nrf2與coilin、SMN之間存在共定

4、位，Bexarotene作用6h后，Coilin的表達增加，且Nrf2與eoilin的共定位增加，與錄抑制劑5-6-dichloro-1-B-D-ribofuranosylbenzimidazole（DRB）對細胞作用1h時的結(jié)果類似；SMN的表達也增加，且Nrf2與SMN的共定位增加，這一結(jié)果與鵝膏蕈堿（α-amanitin）對細胞作用lh時的結(jié)果相似，但是這一現(xiàn)象需要進一步驗證。由此可見Bexarotene可能通過coilin和SM

5、N等亞細胞器對Nrf2進行調(diào)控。
　　 第三部分：為了進一步研究Nrf2和coilin、SMN之間的相互作用關(guān)系，將eoilin轉(zhuǎn)染A549細胞，發(fā)現(xiàn)其與Nrf2存在共定位現(xiàn)象；通過免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)Nrf2與SMN存在相互作用。在其他一些細胞中都可以發(fā)現(xiàn)Nrf2與coilin、SMN的共定位。因此證明Nrf2與coilin、SMN之間存在共定位現(xiàn)象，并且具有普遍性。在結(jié)腸癌Caco2細胞中，可見共定位現(xiàn)象，Bexarotene作用