轉(zhuǎn)錄因子Nrf2對脂多糖誘導Kupffer細胞NF-κB活化的抑制作用及機制研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)是指組織學改變與酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)相似,但排除過多酒精攝入(每周超過210g,連續(xù)五年以上)或其他特殊病因(如營養(yǎng)不良、藥物、病毒等)的一種臨床病理綜合癥[1],其包括廣泛的疾病譜:從單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)、肝硬化到肝癌

2、[2,3]。在歐美等西方國家發(fā)達國家,普通成人NAFLD患病率為20％~33%。在美國,其在兒童和青少年中的發(fā)生率估計在5%~10%,在肥胖人群中可以高達70%[1]。近年,NAFLD在我國人群發(fā)病率逐年增加,已成為主要慢性肝病之一。然而到目前為止其致病機制尚未完全闡明。
　　近年,大量文獻報道腸道微生態(tài)和氧化應激在NAFLD發(fā)病中起重要作用[4-9]。肥胖或高脂飲食引起腸道菌群失衡產(chǎn)生代謝性內(nèi)毒素血癥,大量內(nèi)毒素經(jīng)門脈系統(tǒng)進入肝

3、臟,刺激肝臟庫普弗細胞(kupffercells,KCs)產(chǎn)生大量ROS而導致氧化應激,進一步誘導NF-κB活化和肝臟炎癥,最終觸發(fā)胰島素抵抗(insulinresistance,IR)和NAFLD的發(fā)生,而選擇性敲除KCs,即可消除這種效應。這些發(fā)現(xiàn)顯然不同于經(jīng)典的“二次打擊”學說[11-15],證實內(nèi)毒素誘導KCs活化可能是NAFLD發(fā)病的始發(fā)環(huán)節(jié)。因此,抑制KCs氧化應激及下游NF-κB活化可能有助于防治NAFLD。
　　轉(zhuǎn)

4、錄因子NF-E2相關(guān)因子2(NF-E2-relatedfactor2,Nrf2)是細胞抵御內(nèi)外源性氧化應激的中心環(huán)節(jié),它可以與抗氧化反應元件(antioxidant-responseelement,ARE)結(jié)合,通過上調(diào)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達而降低氧化應激損傷[16,17]。我們前期的研究證實,姜黃素可以通過誘導Nrf2核轉(zhuǎn)位對NASH發(fā)揮保護作用。但Nrf2是否可以通過抑制KCs氧化應激水平,并進一步降低下游NF-κB信號通路

5、活化而延緩NAFLD的發(fā)生,目前尚不明確。
　　因此本實驗利用姜黃素誘導Nrf2核轉(zhuǎn)位,探討其對內(nèi)毒素誘導KCs氧化應激及下游NF-κB信號通路活化和炎癥反應的作用,從而從KCs角度闡明Nrf2對NAFLD的保護作用及機制。
　　目的:
　　體外通過LPS刺激KCs產(chǎn)生氧化應激,觀察NF-κB的表達及下游炎癥因子變化;通過姜黃素干預,研究Nrf2對LPS誘導KCs時氧化應激水平、II相酶(HO-1)表達、NF-κB活化

6、及下游炎癥因子表達的影響,從而為闡明NAFLD的發(fā)病機制提供實驗和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.SD大鼠肝臟KCs的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　2.將KCs分為對照組與LPS組,對照組常規(guī)培養(yǎng),LPS組給予LPS刺激。酶標法檢測丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;細胞免疫熒光法檢測NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況,Westernblot法檢測NF-κB(p65)、IκB

7、α、p-IκBα表達變化,ELISA法檢測TNF-α、IL-1β、IL-6的表達變化。
　　3.將KCs分為對照組、LPS組和姜黃素組,對照組常規(guī)培養(yǎng),LPS組給予LPS刺激,姜黃素組先給予姜黃素干預,余處理同LPS組。細胞免疫熒光法檢測Nrf2的核轉(zhuǎn)位情況,RT-PCR法檢測抗氧化酶HO-1的表達,余指標同上。
　　結(jié)果:
　　1.在密度梯度離心法基礎上加以改良,分離、培養(yǎng)并鑒定KCs,證明用上述方法成功地獲取KCs

8、。
　　2.LPS組MDA水平較對照組顯著增高(P<0.05),而GSH水平顯著低于對照組(P<0.05)。細胞免疫熒光和WesternBlot結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS組胞核NF–κB表達顯著升高;ELISA結(jié)果顯示,LPS組TNF–α、IL–1β和IL–6表達顯著高于對照組(P<0.05)。
　　3.酶標法結(jié)果顯示,LPS組中MDA表達水平明顯高于對照組(P<0.05),姜黃素組顯著低于LPS組(P<0.05)但仍顯

9、著高于對照組;LPS組GSH表達水平顯著低于對照組(P<0.05),姜黃素組GSH表達顯著高于LPS組(P<0.05),但顯著低于對照組(P<0.05)。細胞免疫熒光結(jié)果顯示,LPS組胞核Nrf2表達高于對照組,而姜黃素組高于LPS組;RT–PCR法結(jié)果顯示,LPS組HO–1mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05),姜黃素組HO–1mRNA表達顯著高于LPS組(P<0.05);WesternBlot的結(jié)果顯示,LPS組NF–κBp65

10、表達顯著高于對照組(P<0.05),而顯著低于姜黃素組(P<0.05);ELISA法結(jié)果顯示,LPS組TNF–α、IL–1β和IL–6表達顯著高于對照組(P<0.05),但較姜黃素組顯著降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　本實驗在密度梯度離心法基礎上加以改良,分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠KCs,成功獲取KCs;證實LPS能夠增加KCs內(nèi)氧化應激水平,促進KCs的NF-κB的核轉(zhuǎn)位及下游炎癥因子TNF–α、IL–1β和IL–6表達