核轉(zhuǎn)錄因子NRF2在砷誘導小鼠胰島β細胞毒性損傷中的作用機制.pdf

1、目的：
　　 砷廣泛存在于自然界中，包括無機砷和有機砷。人類可以通過環(huán)境、職業(yè)暴露或者使用含砷藥物而接觸到無機砷，長期砷暴露可引發(fā)多種疾病，大量流行病學調(diào)查資料顯示：砷污染是暴露人群的2型糖尿病發(fā)生的重要因素之一。但砷導致2型糖尿病發(fā)生的機制仍不明確，目前，醫(yī)學界認為氧化應激可能是造成2型糖尿病胰島β細胞損傷的重要病理機制之一，而砷中毒發(fā)病機制的重要理論就是氧化應激學說，因此砷暴露導致胰島β細胞毒性損傷可能與氧化應激有關(guān)。核轉(zhuǎn)錄

2、因子Nrf2(Nuclear factor-erythroid2-related factor2)屬于CNC堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族成員，是啟動細胞抗氧化反應的主要調(diào)控因子。因此在本研究中，首先，應用穩(wěn)定的Nrf2基因沉默小鼠胰島β細胞MIN6和從Nrf2基因敲除小鼠中分離的胰島，在急性高劑量砷暴露的條件下，應用光學顯微鏡、MTT、流式細胞儀等實驗技術(shù)觀察砷暴露導致的細胞毒性在Nrf2基因沉默MIN6細胞和Nrf2基因敲除的胰島中的變化；

3、其次，應用qReal-time RT-PCR和Western Blotting等實驗技術(shù)檢測砷對Nrf2及其ARE目的基因表達的影響。從而闡明Nrf2在砷誘導的小鼠胰島β細胞和分離的胰島抗氧化反應和細胞毒性過程中的作用機制，為預防和治療砷致糖尿病提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法
　　 1、細胞培養(yǎng)：小鼠胰島β細胞系MIN6
　　 2、建立Nrf2基因沉默小鼠胰島β細胞系MIN6
　　 3、通過MTT法檢測急

4、性砷暴露對Scr和Nrf2-KD細胞的急性細胞毒性損傷情況
　　 4、利用流式細胞儀和Western Blotting檢測急性砷誘導Scr和Nrf2-KD細胞的凋亡情況
　　 5、利用相差顯微鏡觀察急性砷暴露對WT和Nrf2-KO小鼠胰島毒性損傷情況
　　 6、利用qReal-time RT-PCR和Western Blotting檢測急性砷暴露對Nrf2的基因和蛋白的表達情況
　　 7、利用qReal-

5、time RT-PCR檢測急性砷暴露對ARE目的基因的表達情況
　　 8、利用qReal-time RT-PCR檢測急性砷暴露對Nrf2基因敲除的小鼠胰島Nrf2和ARE目的基因的表達影響
　　 9、應用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism5進行數(shù)據(jù)處理分析與制圖
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、建立Nrf2基因沉默小鼠胰島β細胞系MIN6
　　 qReal-time RT-PCR和Western B

6、lotting結(jié)果顯示：Nrf2基因沉默(Nrf2-KD)細胞Nrf2的mRNA和蛋白表達水平均低于Scr細胞。
　　 2、急性砷暴露對Scr和Nrf2-KD細胞的急性細胞毒性
　　 應用2、4、6、8、10、12、14、16μM的亞砷酸鈉和0.5、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μM MMA3+處理Scr和Nrf2-KD細胞24 hrs，Scr和Nrf2-KD細胞活性均隨著亞砷酸鈉和MMA3+濃度的增高而逐漸

7、變低，Nrf2-KD細胞對亞砷酸鈉和MMA3+的急性毒性比Scr細胞更敏感。
　　 3、流式細胞儀檢測急性砷誘導Scr和Nrf2-KD細胞凋亡
　　 應用6、8和10μM的亞砷酸鈉處理Scr和Nrf2-KD細胞24 hrs，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)Nrf2-KD細胞凋亡比例較同劑量組Scr組增高。
　　 4、Western Blotting檢測急性砷誘導Scr和Nrf2-KD細胞caspase-3的表

8、達
　　 應用2、4、6、8和10μM的亞砷酸鈉處理Scr和Nrf2-KD細胞24 hrs，WesternBlotting檢測cleaved-caspase-3，結(jié)果顯示：Nrf2-KD細胞表達量明顯高于同劑量組Scr細胞。
　　 5、急性砷暴露對tBHQ預處理的Scr和Nrf2-KD細胞的毒性損傷
　　 Scr細胞被50μM tBHQ預處理6hrs后，再經(jīng)不同劑量(4、6、8、10、12μM)的亞砷酸鈉處理24

9、hrs，結(jié)果可見經(jīng)tBHQ預處理后的Scr細胞活性上調(diào)，而Nrf2-KD細胞中未見到細胞活性有改變。
　　 6、急性砷暴露對Nrf2基因敲除的小鼠胰島的毒性損傷
　　 分離的胰島在體外培養(yǎng)48hrs后，分三個實驗組：對照組、iAS3+20μM染毒組、iAS3+50μM染毒組；每個實驗組均由各100個隨機挑選的WT小鼠胰島組和Nrf2-KO小鼠胰島組構(gòu)成，在不同時間點(8、12、16、24hrs)用倒置顯微鏡觀察每個實驗組

10、存留的胰島數(shù)量并照相。統(tǒng)計結(jié)果顯示：Nrf2-KO小鼠胰島對亞砷酸鈉毒性損傷比WT更敏感。
　　 7、急性砷暴露對小鼠胰島β細胞Nrf2基因與蛋白表達的影響
　　 Scr和Nrf2-KD細胞暴露于不同濃度的亞砷酸鈉(2、4、6、8和10μM)6hrs或4μM亞砷酸鈉不同時間點(2、6、12、18、24hrs)，結(jié)果顯示：亞砷酸鈉對Scr細胞總Nrf2和核內(nèi)Nrf2蛋白水平的激活作用存在明顯的時間和劑量效應，但對Nrf2的

11、mRNA表達影響不顯著。Nrf2-KD細胞與Scr細胞相比時間和劑量效應不顯著。
　　 8、急性砷暴露致小鼠胰島β細胞ARE目的基因表達的影響
　　 Scr和Nrf2-KD細胞暴露于不同濃度的亞砷酸鈉(0、2、4、6、8和10μM)6hrs或4μM亞砷酸鈉不同時間點(0、2、6、12、18、24hrs)，實驗結(jié)果表明，亞砷酸鈉對ARE目的基因(Nqol、Hmox-1、Gclc、Srx)激活作用存在明顯的時間和劑量效應，N

12、rf2-KD細胞與Scr細胞相比時間和劑量效應不顯著。
　　 9、急性砷暴露對Nrf2基因敲除的小鼠胰島Nrf2和ARE目的基因的表達影響
　　 WT和Nrf2-KO小鼠胰島暴露于5μM亞砷酸鈉6hrs，結(jié)果表明，生理條件下或亞砷酸鈉染毒，Nrf2-KO小鼠胰島均未見Nrf2表達。在正常生理條件下，ARE目的基因Nqol、Hmox-1、Gclc、和Srx在Nrf2-KO小鼠胰島中表達均低于WT小鼠胰島，亞砷酸鈉染毒后，W

13、T小鼠胰島的ARE目的基因顯著升高，而Nrf2-KO小鼠胰島ARE目的基因表達增高不顯著。
　　 結(jié)論：
　　 1、Nrf2基因沉默的小鼠胰島β細胞MIN6對急性砷暴露誘導的細胞毒性損傷更敏感。
　　 2、Nrf2基因敲除的小鼠胰島對急性砷暴露誘導的細胞毒性損傷更敏感。
　　 3、Nrf2基因沉默的小鼠胰島β細胞MIN6明顯降低了抵抗急性砷暴露誘導的氧化應激反應的能力
　　 4、Nrf2基因敲除的