轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧誘導粘蛋白MUC5AC表達中的作用.pdf

1、研究背景
　　 香煙煙霧中含有大量的氧化劑、自由基和有機物基團，有些物質(zhì)可以長期沉積在肺組織小氣道中。香煙煙霧給肺組織帶來持續(xù)的氧化物刺激，造成明顯的氧化應急。長期吸煙的患者氣道標志性的改變包括氣道上皮杯狀細胞化生和增生，導致粘液分泌增多。
　　 氣道黏液是不同成分分泌物的混合物，根據(jù)其特性分為凝膠形成蛋白和膜相關黏蛋白兩大類。其中4種凝膠形成黏蛋白MUC2、MUC5AC、MUC5B及MUC19主要表達于氣道中，由氣道上

2、皮的杯狀細胞和粘膜下腺的粘液細胞分泌。氣道中的粘液能夠吸附一些顆粒和病原菌，以便通過纖毛上皮的纖毛運動予以清除。氣道上皮細胞MUC5AC及MUC5B的分泌過度是引起支氣管炎咳嗽咳痰癥狀的原因。無論是人類還是動物模型中，氣道疾病如囊性肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等如合并氣道粘液過度分泌往往使得發(fā)病率和病死率進一步惡化。
　　 紅細胞系統(tǒng)核因子相關因子2(nuclearfactorerythroid2relatedfactor2

3、，Nrf2)是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛表達于如肝臟、腎臟、肺等多種組織。Nrf2介導的抗氧化反應是一種主要的細胞防御機制。Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應激源的細胞毒性，導致細胞功能障礙、凋亡甚至死亡。
　　 目前尚無Nrf2在香煙煙霧誘導MUC5AC表達中作用的研究報導，我們希望通過本研究明確Nrf2在香煙煙霧誘導MUC5AC表達和氣道炎癥中的作用，并通過這一研究找到香煙相關的氣道炎癥、粘液分泌

4、過度的新的治療靶點。
　　 研究內(nèi)容
　　 第一部分香煙煙霧溶液誘導A549細胞粘蛋白MUC5AC及核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達
　　 目的：1、制備穩(wěn)定的香煙煙霧溶液；2、通過MTT法檢測香煙煙霧溶液對A549細胞的毒性，確定后續(xù)實驗需要的合適煙霧溶液濃度；3、通過煙霧溶液刺激A549細胞并檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達，為后續(xù)研究確定合適的煙霧干預時間和濃度。
　　 方法：1、制備香煙煙霧

5、溶液，以分光光度儀測定OD320,檢測穩(wěn)定性；2、通過MTT方法檢測香煙煙霧溶液對A549細胞的毒性；3、不同時間香煙煙霧孵育A549細胞后以Q-PCR和WB方法分別檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達。
　　 結(jié)果：1、連續(xù)14天制備的香煙煙霧溶液OD320平均為0.7394，標準差0.05804，95％可信區(qū)間為0.7213-0.7575，單因素方差分析提示數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示該方法得到的數(shù)據(jù)一

6、致性很好，該方法穩(wěn)定。2、通過MTT法提示香煙煙霧溶液隨著濃度的增高孵育時間延長，對A549細胞的抑制率增大。10%及以下濃度抑制率明顯小于25%以上濃度。10%濃度煙霧溶液在48小時抑制率明顯增高，孵育時間小24小時各時間點抑制率差別不明顯。3、10%煙霧溶液孵育A549細胞可以促進Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達，表達量隨著時間的延長而增加，至24小時可以達到最高。
　　 小結(jié)：1、本研究采用的香煙煙霧溶液方法得到

7、的結(jié)果穩(wěn)定，該溶液對人肺上皮樣細胞A549體外有細胞毒作用，呈時間和濃度依賴性。2、香煙煙霧溶液可以誘導A549細胞粘蛋白MUC5AC的表達，這一作用在24小時內(nèi)呈時間依賴性。3、香煙煙霧溶液可以誘導A549細胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達。
　　 第二部分核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧溶液誘導A549細胞粘蛋白MUC5AC表達中的作用
　　 目的：1、驗證抑制A549細胞Nrf2基因表達可以增加香煙煙霧誘導MUC5AC的作用

8、；2、驗證過表達A549細胞Nrf2基因表達可以減弱香煙煙霧誘導MUC5AC的作用；3、乙酰半胱氨酸對香煙煙霧誘導MUC5AC的作用有保護作用。
　　 方法：1、以小干擾RNA抑制A549細胞Nrf2基因基礎上，再以香煙煙霧溶液孵育A549細胞后分別以Q-PCR和WB方法檢測Nrf2和MUC5AC的mRNA和蛋白表達；2、以pCDNA3-Myc3-Nrf2質(zhì)粒過表達A549細胞Nrf2基因基礎上，再以香煙煙霧溶液孵育A549細胞

9、后分別以Q-PCR和WB方法檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達；3、以乙酰半胱氨酸干預煙霧溶液對A549細胞的作用后，以Q-PCR方法分別檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN表達。
　　 結(jié)果：1、小干擾RNA有效抑制Nrf2的表達，陰性對照小于擾RNA組CSE刺激后MUC5AC蛋白表達增加64.33%，干擾組CSE刺激后MUC5AC蛋白表達增加195.33%，是前者的三倍多，兩者的差別有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.0

10、01)。2、pCDNA3-Myc3-Nrf2質(zhì)?？梢杂行Т龠MNrf2的表達，給予空質(zhì)粒對照組煙霧誘導MUC5AC蛋白增高約47.44%，pCDNA3-Myc3-Nrf2過表達后，煙霧誘致MUC5AC蛋白增高約25.74%，過表達Nrf2可以使煙霧誘導MUC5AC蛋白的量下降45.73%，兩者的差別有明顯的統(tǒng)計學意義(p<0.05)。3、20mMNAC可以促進Nrf2mRNA表達，減弱煙霧溶液誘導A549細胞MUC5ACmRNA的表達。<

11、br>　　 小結(jié)：1、在以siRNA有效敲除A549細胞Nrf2基因后，香煙煙霧誘導的MUC5AC較未敲除前增加程度增加。2、在以pCDNA3-myc3-Nrf2質(zhì)粒過表達A549細胞Nrf2基因后，香煙煙霧誘導的MUC5AC較未敲除前增加明顯減少。3、N-乙酰半胱氨酸體外可以促進Nrf2基因表達，并可以減少香煙煙霧誘導MUC5AC的作用。
　　 第三部分核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧誘導小鼠氣道炎癥及肺組織粘蛋白MUC5AC表

12、達中的作用
　　 目的：1、驗證Nrf2在香煙煙霧誘導小鼠氣道炎癥中的保護性作用。2、驗證Nrf2在香煙煙霧誘導小鼠粘蛋白MUC5AC表達中的保護性作用
　　 方法：1、分別給予正常ICR小鼠和Nrf2-/-ICR小鼠不同時間的短期(3、7和14天)熏煙后，通過無創(chuàng)氣道反應性測定、支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù)、肺組織病理切片炎癥評分等方法明確香煙煙霧誘導的氣道炎癥及Nrf2在其中所起的作用。2、分別給予正常ICR小鼠和Nrf

13、2-/-ICR小鼠不同時間的短期(3、7和14天)熏煙后，通過肺組織病理切片PAS染色、通過WB測定肺組織蛋白中Nrf2蛋白的含量以及通過ELISA的方法檢測支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC蛋白含量來比較各組粘液及粘蛋白MUC5AC表達情況及與Nrf2的關系。
　　 結(jié)果：1、短期熏煙后，正常ICR小鼠氣道反應性均會增高，BLAF種細胞總數(shù)增加，中性粒細胞比例略增高，肺組織病理切片中炎癥評分會升高，熏煙時間延長，以上改變更明顯；敲

14、除Nrf2后，以上現(xiàn)象變得更加明顯。2、短期熏煙后，Nrf2-/-小鼠肺組織病理切片PAS評分明顯高于相同時間熏煙的正常ICR組，BALF中MUC5AC蛋白含量隨薰煙時間延長明顯增高。
　　 小結(jié)：1、短期香煙煙霧作用可以使Nrf2-/-小鼠表現(xiàn)為更明顯的中性粒細胞為主的氣道炎癥及氣道反應性明顯增高。2、短期香煙煙霧作用可以使小鼠肺部粘蛋白MUC5AC表達增加，Nrf2-/-小鼠表現(xiàn)更加明顯。
　　 結(jié)論