COX-2-PGE2途徑介導(dǎo)LPS對人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞MUC2和MUC5AC的誘導(dǎo)作用.pdf

1、前言：
　　肝內(nèi)膽管結(jié)石是一種主要發(fā)生于東亞的地區(qū)性疾病，其發(fā)病機(jī)制仍沒有完全研究清楚。既往研究顯示慢性增生性膽管炎癥是肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病因素之一。在炎癥過程中，一系列炎癥介質(zhì)的釋放可能是肝內(nèi)膽管結(jié)石發(fā)病的重要機(jī)制。動物實驗中發(fā)現(xiàn)外源性PGE2能夠引起肝內(nèi)膽管出現(xiàn)類似于膽管炎樣的形態(tài)改變。而伴有肝內(nèi)膽管結(jié)石的膽管上皮表達(dá)更多的COX-2和PGE2。此外，研究發(fā)現(xiàn)PGE2能夠促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞增殖。這些研究提示COX-2/PGE2過度

2、表達(dá)參與了慢性增生性膽管炎及肝內(nèi)結(jié)石的發(fā)病過程。
　　慢性增生性膽管炎引起肝內(nèi)結(jié)石的重要原因之一為MUC（粘蛋白的蛋白部分）的過度分泌。研究顯示含結(jié)石的肝內(nèi)膽管上皮MUC2和MUC5AC表達(dá)顯著高于正常肝內(nèi)膽管上皮，提示MUC2和MUC5AC參與了肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成過程。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)慢性增生性膽管炎伴有肝內(nèi)膽管結(jié)石患者膽汁中含有高水平的磷脂酶A2，同時伴隨LPS、PGE2及MUC2和MUC5AC表達(dá)增多。綜合以上研究結(jié)果，我

3、們推測在慢性增生性膽管炎中，COX-2/PGE2可能介導(dǎo)了MUC2和MUC5AC過度分泌，并促進(jìn)了肝內(nèi)膽管結(jié)石的發(fā)病過程。
　　在本實驗中，我們將首次采用體外培養(yǎng)的人類肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞作為研究對象，以LPS作為刺激因素，觀察研究COX-2/PGE2在肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的表達(dá)情況，同時檢測MUC2和MUC5AC的表達(dá)狀態(tài)。采用COX-2抑制劑及外源性PGE2處理等手段探討COX-2/PGE2是否介導(dǎo)了MUC2和MUC5AC的表達(dá)上調(diào)過

4、程，并對其中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行研究和探索。
　　材料和方法：
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEC(Human Intrahepatic Biliary Epithelial Cells)及培養(yǎng)液購于美國ScienCell公司;COX-2多克隆抗體購自于武漢博士得公司;TLR4、NFκBp65、EP4多克隆抗體及MUC2、MUC5AC單克隆抗體購自于Santa Cruz公司（美國）;PGE2 ELISA試劑盒購自于Biotrak

5、 Amersham公司（英國）;RNAisoReagent和SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit購自于大連寶生物工程公司; TLR4拮抗劑E5564購自美國EB16-Science公司;內(nèi)毒素、NFκB抑制劑PDTC、EP4抑制劑AH23848、 COX-2抑制劑NS-398和PGE2購自于美國Sigma公司。
　　CO2培養(yǎng)箱，日本Sanyo公司;LightCycler PCR儀，瑞士Roche Diagn

6、otics公司;全自動酶標(biāo)儀ST-360，日本KHB公司;5810R低溫超速離心機(jī)，德國EFFENDORF公司;凝膠自動成像分析系統(tǒng)，美國PERSONALFX公司;UVMINI-1204紫外分光光度計，日本島津公司;MDF-U32V深凍冰箱，日本Sanyo公司等。
　　采用RNAiso reagent進(jìn)行RNA提取;RNA檢測采用real-time PCR技術(shù);蛋白檢測采用Western blot技術(shù);細(xì)胞上清液中蛋白檢測采用El

7、isa法。
　　兩者比較采用student'st檢驗，不同時間點比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有顯著性差異。采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1、COX-2和PGE2在人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及LPS對其表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)存在較弱的COX-2蛋白表達(dá)。在經(jīng)LPS作用后，COX-2蛋白和mRNA表達(dá)均顯著增加(P＜0.01)，其中在6小時后增加最為顯著，CO

8、X-2mRNA表達(dá)水平增加到基礎(chǔ)表達(dá)的24.6倍。人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞經(jīng)LPS(1μg/ml)作用后，細(xì)胞上清液中PGE2含量顯著增加（P＜0.01）。
　　2、LPS受體TLR4介導(dǎo)LPS對COX-2/PGE2表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞存在TLR4蛋白和mRNA表達(dá)，經(jīng)LPS作用后，TLR4蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高，其中TLR4 mRNA表達(dá)水平升高了3.6倍(P＜0.01)。經(jīng)TLR4拮抗劑E5564預(yù)處

9、理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。COX-2 mRNA表達(dá)未出現(xiàn)顯著增加。同時，細(xì)胞上清液中PGE2含量亦未出現(xiàn)顯著升高。結(jié)果顯示LPS對COX-2和PGE2的誘導(dǎo)作用被TLR4拮抗劑E5564抑制。
　　3、核轉(zhuǎn)錄因子NFκB介導(dǎo)LPS對COX-2/PGE2表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞核內(nèi)存在NFκBp65表達(dá)，經(jīng)LPS作用后，NFκBp65表達(dá)水平升高。結(jié)果顯示LPS能夠促進(jìn)NFκBp65向核內(nèi)移位

10、。經(jīng)NFκB抑制劑PDTC預(yù)處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。COX-2 mRNA表達(dá)未出現(xiàn)顯著增加。同時，細(xì)胞上清液中PGE2含量亦未出現(xiàn)顯著升高。結(jié)果顯示LPS對COX-2和PGE2的誘導(dǎo)作用被NFκB抑制劑PDTC阻斷。
　　4、MUC2在人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及LPS對其表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)存在較弱的MUC2蛋白表達(dá)。在經(jīng)LPS作用后，MUC2蛋白和mRNA表達(dá)均顯著增加(P＜0

11、.01)，其中在12小時后增加最為顯著，MUC2mRNA表達(dá)水平增加到基礎(chǔ)表達(dá)的15.5倍。
　　5、MUC5AC在人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及LPS對其表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)存在MUC5AC蛋白表達(dá)。在經(jīng)LPS作用后，MUC5AC蛋白和mRNA表達(dá)均顯著增加(P＜0.01)，其中在12小時后增加最為顯著，MUC5AC mRNA表達(dá)水平增加到基礎(chǔ)表達(dá)的26.2倍。
　　6、LPS受體TLR4介導(dǎo)LP

12、S對MUC2和MUC5AC表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　經(jīng)TLR4拮抗劑E5564預(yù)處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表達(dá)均未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用被TLR4拮抗劑E5564抑制。
　　7、核轉(zhuǎn)錄因子NFκB介導(dǎo)LPS對MUC2和MUC5AC表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　經(jīng)NFκB抑制劑PDTC預(yù)處理后，然后采用LPS作

13、用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。MUC2 mRNA及MUC5AC mRNA表達(dá)均未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用被NFκB抑制劑PDTC阻斷。
　　8、 PGE2受體EP4在人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)及LPS對其表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞內(nèi)存在EP4蛋白和mRNA表達(dá)，經(jīng)LPS作用后，EP4蛋白和mRNA表達(dá)水平均升高，其中EP4 mRNA表達(dá)水平升高了5.2倍(P＜

14、0.01)。經(jīng)EP4抑制劑AH23848預(yù)處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。MUC2mRNA及MUC5AC mRNA表達(dá)均未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2 mRNA和MUC5AC mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用被EP4抑制劑AH23848阻斷。
　　9、COX-2抑制劑抑制LPS對MUC2和MUC5AC表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
　　經(jīng)COX-2抑制劑NS-398預(yù)處理后，然后采用LPS作用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞。MUC2 m

15、RNA及MUC5AC mRNA表達(dá)未出現(xiàn)顯著增加。結(jié)果顯示LPS對MUC2mRNA和MUC5AC mRNA表達(dá)的誘導(dǎo)作用可被COX-2抑制劑NS-398抑制。
　　10、外源性PGE2誘導(dǎo)細(xì)胞MUC2和MUC5AC的表達(dá)。
　　采用外源性PGE2作用人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，MUC2蛋白和mRNA表達(dá)顯著升高，其mRNA表達(dá)升高17.3倍(P＜0.01)。同時，MUC5AC蛋白和mRNA表達(dá)亦顯著升高，其mRNA表達(dá)升高了21.4

16、倍(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、LPS可上調(diào)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞COX-2/PGE2表達(dá)，提示COX-2/PGE2途徑參與了人肝內(nèi)膽管炎癥過程。LPS受體TLR4及NFκB介導(dǎo)了LPS對人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞COX-2/PGE2表達(dá)的調(diào)節(jié)過程。
　　2、LPS可誘導(dǎo)人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞表達(dá)MUC2和MUC5AC，提示肝內(nèi)膽管炎癥能引起MUC2和MUC5AC分泌增多。LPS受體TLR4及NFκB參與了LPS對人肝內(nèi)膽管