黏蛋白基因MUC5AC在支氣管哮喘小鼠和人氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、氣道杯狀細(xì)胞增生(GCH)是支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱哮喘)的重要病理特征，并伴隨著儲(chǔ)存和所分泌的黏蛋白(MUC)的變化，從而導(dǎo)致哮喘患者痰液產(chǎn)生、氣道狹窄、癥狀發(fā)作和肺功能急劇下降等。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞和Th2型細(xì)胞因子是GCH的重要介質(zhì)，MUC5AC則是表達(dá)在氣道杯狀細(xì)胞上的主要MUC基因，但細(xì)胞因子所誘導(dǎo)的GCH的機(jī)制、MUC基因上調(diào)與GCH的關(guān)系以及新近發(fā)現(xiàn)的“鈣激活的氯通道”在其中的作用目前尚不清楚，因此，本研究應(yīng)用分子生

2、物學(xué)技術(shù)和方法，通過系統(tǒng)探討MUC5AC基因在哮喘小鼠氣道和正常人氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)及分子調(diào)控機(jī)制以及糖皮質(zhì)激素的治療作用，以期為哮喘臨床治療提供新的靶點(diǎn)。 第一部分Gob-5對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)的調(diào)控作用研究 分題一Gob-5在哮喘小鼠氣道的表達(dá)及與MUC5AC關(guān)系的研究 目的：研究“鈣激活的氯通道”基因家族的小鼠成員gob-5在哮喘小鼠氣道的表達(dá)及與MUC5AC和黏液分泌的關(guān)系。 方法：16

3、只BALB/c小鼠分為對(duì)照組和哮喘組，觀察BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織病理和氣道杯狀細(xì)胞改變，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)染色分別檢測(cè)氣道gob-5和白細(xì)胞介素(IL)-4mRNA以及MUC5AC蛋白。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，哮喘組肺組織和BALF中嗜酸性粒細(xì)胞以及氣道杯狀細(xì)胞均明顯增多；哮喘組氣道gob-5、IL-4mRNA和MUC5AC蛋白(分別為0.2297±0.0559、0.6536±0.0797和0.

4、6637±0.0663)較對(duì)照組(分別為0、0.2317±0.0373和0.2060±0.0736)均明顯增加(P均＜0.01)；哮喘組氣道gob-5mRNA與MUC5AC蛋白之間呈直線正相關(guān)(r=0.864，P＜0.01)。 結(jié)論：Gob-5在促進(jìn)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)和黏液過度分泌中可能起重要作用，Th2型細(xì)胞因子IL-4可能是該通道合成和選擇性表達(dá)的刺激因子，抑制該通道將為哮喘治療提供新的策略。 分題二Gob

5、-5反義寡核苷酸對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)的作用 目的：探討gob-5反義寡核苷酸對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)的作用。方法：32只BALB/c小鼠分為哮喘組、gob-5反義寡核苷酸組(ASODN組)、gob-5正義寡核營(yíng)酸組(SODN組)和對(duì)照組，進(jìn)行BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)，用RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和Westernblot分別檢測(cè)氣道gob-5mRNA和MUC5AC蛋白。 結(jié)果：ASODN組BALF嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)

6、較哮喘組明顯減少。哮喘組氣道gob-5mRNA和MUC5AC蛋白(分別為0.2502±0.0401和0.7246±0.1036)均較對(duì)照組(分別為0和0.2478±0.0423)明顯增加(P均＜0.01)；ASODN組(分別為0.0004±0.0003和0.2487±0.0413)較哮喘組均明顯降低(P均＜0.05)，且和對(duì)照組相比差異無顯著性(P＞0.05)；SODN組(分別為0.2499±0.0402和0.5700±0.2007)和

7、哮喘組相比差異均無顯著性(P均＞0.05)，和對(duì)照組相比均明顯增高(P分別＜0.01、0.05)，和ASODN組相比也均明顯增高(P均＜0.01)。哮喘組和ASODN組氣道gob-5mRNA與MUC5AC蛋白之間均呈直線正相關(guān)(r分別=0.973、0.966，P均＜0.01)。 結(jié)論：Gob-5反義寡核苷酸可有效抑制哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)，阻斷gob-5可能對(duì)哮喘氣道黏液過度分泌具有治療作用。 第二部分IL-13對(duì)

8、哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)作用機(jī)制的研究分題一IL-13對(duì)哮喘小鼠氣道gob-5及MUC5AC表達(dá)的作用 目的：研究IL-13對(duì)哮喘小鼠氣道gob-5和MUC5AC表達(dá)的影響及其在氣道黏液分泌中的作用。 方法：45只BALB/c小鼠分為對(duì)照組、哮喘組和IL-13組，用RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和Westernblot分別檢測(cè)氣道gob-5mRNA、MUC5ACmRNA和蛋白。結(jié)果：哮喘組氣道gob-5mRNA(1.

9、136±0.007)較對(duì)照組(0)明顯增加(P＜0.01)，IL-13組(1.246±0.008)較對(duì)照組和哮喘組也均明顯增加(P均＜0.01)；哮喘組氣道MUC5ACmRNA和蛋白(分別為0.161±0.011和7只小鼠陽(yáng)性)較對(duì)照組(分別為0.070±0.004和2只小鼠陽(yáng)性)明顯增加(P分別＜0.01、0.05)，IL-13組(分別為0.250±0.014和13只小鼠陽(yáng)性)較對(duì)照組和哮喘組也均明顯增加(兩組P分別＜0.01、0.0

10、1和0.01、0.05)；哮喘組和IL-13組氣道gob-5mRNA與MUC5ACmRNA之間均呈直線正相關(guān)(r分別=0.986、0.961，P均＜0.01)。 結(jié)論：Gob-5是促進(jìn)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)和氣道黏液過度分泌的重要基因，其機(jī)制可能是由于Th2型細(xì)胞因子IL-13的誘導(dǎo)作用。 分題二IL-13對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5AC及Bcl-2、Bax表達(dá)的作用 目的：研究IL-13對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5A

11、C、Bcl-2和Bax表達(dá)的作用，探討氣道黏液過度分泌的機(jī)制。 方法：24只BALB/c小鼠分為對(duì)照組、哮喘組和IL-13組，觀察肺組織病理改變，用RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色和Westernblot分別檢測(cè)氣道MUC5ACmRNA和蛋白、Bcl-2以及Bax蛋白。 結(jié)果：(略） 結(jié)論：IL-13是引起哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)和黏液過度分泌的重要細(xì)胞因子，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax在其中可能起著重要作用

12、。 第三部分糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)作用的研究 目的：研究糖皮質(zhì)激素對(duì)哮喘小鼠氣道MUC5AC表達(dá)的影響，探討其對(duì)氣道黏液過度分泌的可能作用機(jī)制。 方法：24只BALB/c小鼠分為對(duì)照組、哮喘組和地塞米松組，觀察BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)和氣道杯狀細(xì)胞變化，用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色分別檢測(cè)氣道MUC5ACmRNA和蛋白、IL-4mRNA。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，哮喘組BALF嗜酸性粒細(xì)胞和氣道

13、杯狀細(xì)胞均明顯增多，而地塞米松組處理后明顯減少；哮喘組氣道MUC5ACmRNA和蛋白以及IL-4mRNA(分別為0.5341±0.0303、0.1905±0.0008和0.6265±0.0932)均較對(duì)照組(分別為0.1994±0.0128、0.1194±0.0007和0.2389±0.0289)明顯增加(P均＜0.01)，地塞米松組(分別為0.2729±0.0345、0.1456±0.0003和0.2424±0.0260)又較哮喘組均

14、明顯降低(P分別＜0.05、0.01、0.01)，但地塞米松組IL-4mRNA和對(duì)照組相比差異無顯著性(P＞0.05)，MUC5ACmRNA和蛋白和對(duì)照組相比均明顯降低(P均＜0.01)。 結(jié)論：糖皮質(zhì)激素可減輕哮喘小鼠肺組織炎癥，并可能通過下調(diào)MUC5AC和IL-4表達(dá)在氣道黏液過度分泌中起治療作用。 第四部分尼氟滅酸和糖皮質(zhì)激素對(duì)IL-13誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞hCLCA1表達(dá)的作用及與MUC5AC表達(dá)關(guān)系的研究

15、 目的：研究尼氟滅酸和糖皮質(zhì)激素對(duì)IL-13誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞hCLCA1表達(dá)的作用及與MUC5AC表達(dá)的關(guān)系，探討對(duì)它們氣道黏液分泌的作用和機(jī)制。方法：培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞株HBE4，IL-13誘導(dǎo)其表達(dá)hCLCA1mRNA后以尼氟滅酸和地塞米松分別處理48h，RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Westernblot分別檢測(cè)氣道hCLCA1mRNA、MUC5ACmRNA和蛋白。 結(jié)果：IL-13刺激HBE4細(xì)胞5d時(shí)可以誘導(dǎo)其

16、表達(dá)hCLCA1mRNA；IL-13組hCLCA1mRNA(0.5354±0.0958)明顯高于對(duì)照組(0)(P＜0.01)，尼氟滅酸組(0.2775±0.0534)明顯低于IL-13組(P＜0.01)，地塞米松組(0.5191±0.1021)和IL-13組差異無顯著性(P＞0.05)；IL-13組MUC5ACmRNA和蛋白(分別為0.6381±0.1607和3.7525±0.3591)明顯高于對(duì)照組(0.0920±0.0216和0.7

17、731±0.1613)(P均＜0.01)，尼氟滅酸組(0.3582±0.0807和1.3606±0.1660)和地塞米松組(0.3785±0.0523和1.3512±0.1439)均明顯低于IL-13組(P均＜0.01)。相關(guān)分析表明，IL-13組hCLCA1與MUC5ACmRNA之間呈直線正相關(guān)(r=0.906，P＜0.01)。 結(jié)論：尼氟滅酸可阻斷HBE4細(xì)胞hCLCA1和MUC5AC表達(dá)，而糖皮質(zhì)激素僅可下調(diào)MUC5AC，