化痰活血方和梓醇拮抗哮喘小鼠炎癥和黏蛋白MUC5AC機(jī)制的研究.pdf

1、目的：化痰活血這種治法常用于臨床，梓醇是化痰活血方地黃的有效成分之一，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)化痰活血方和梓醇對哮喘小鼠有一定治療作用，其機(jī)制可能通過干預(yù)Notch信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制哮喘哮喘小鼠中Th2細(xì)胞的異?；罨?，調(diào)節(jié)哮喘中Th1/Th2失衡，增加γ干擾素（INF-γ）分泌，減少白介素4（IL-4）和白介素17A（IL-17A）在哮喘小鼠肺泡灌洗液中的分泌。本次研究旨在探討化痰活血方和梓醇拮抗哮喘小鼠炎癥和黏蛋白MUC5AC的作用機(jī)制。體

2、外細(xì)胞水平研究梓醇對刺激劑EGF誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞上清液黏蛋白MUC5AC的影響。
　　方法：
　　1.采用多次腹腔注射并霧化激發(fā)卵清白蛋白（OVA）的方式建立小鼠哮喘模型。實驗第1、8、15d腹腔注射OVA，第21d起用2％OVA霧化激發(fā)，連續(xù)霧化7d的方式建立哮喘模型。實驗9d起至第27d，分別灌胃化痰活血方和梓醇進(jìn)行干預(yù)，第28d取樣觀察化痰活血方和梓醇對哮喘小鼠炎癥和黏蛋白MUC5AC的影響。實驗霧化期間，第25、

3、26、27d觀察小鼠的整體狀況并記錄引喘潛伏期；
　　2.哮喘小鼠末次激發(fā)24h后，肺功能儀測定氣道阻力(RI)；
　　3.病理切片HE、PAS染色觀察肺組織病理變化和杯狀細(xì)胞增生的情況；
　　4.BALF沉淀用細(xì)胞涂片瑞氏吉姆薩染色檢測炎性細(xì)胞的變化；
　　5.酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測BALF中IL-5、MUC5AC、IL-10和TGF-β1含量的變化；
　　6.MTT法檢測梓醇對刺激劑EGF誘導(dǎo)的1

4、6HBE細(xì)胞株活性的影響；
　　7.ELISA檢測梓醇對16HBE細(xì)胞上清液中MUC5AC的影響；
　　結(jié)果：
　　1.霧化吸入OVA后，除正常組外，模型組小鼠出現(xiàn)頭、鼻部瘙癢、呼吸急促、毛發(fā)豎起、活動量減少等表現(xiàn)，多次激發(fā)后，小鼠出現(xiàn)體重下降、毛發(fā)雜亂無光澤等癥狀，給予化痰活血方和梓醇干預(yù)后上述癥狀均得到不同程度的緩解，且化痰活血方組和梓醇組哮喘小鼠的哮喘潛伏期明顯比模型組延長（P＜0.01）；
　　2.各組小

5、鼠氣道阻力值RI均隨著乙酰甲膽堿濃度的增加（0、6.25、12.5、25、50mg/mL）而增大，模型組氣道阻力值RI明顯大于正常組，在25mg/mL和50mg/mL時差異最顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），給予不同劑量的化痰活血方和梓醇干預(yù)后，RI值均不同程度的下降（P＜0.05或P＜0.01）；
　　3.哮喘組小鼠氣管、肺泡及肺間質(zhì)周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，基底膜增厚，氣道粘膜上皮脫落，粘膜上皮不完整，黏蛋白高分泌和杯狀細(xì)胞增

6、生，化痰活血方和梓醇干預(yù)后上述癥狀得到不同程度緩解；病理評分結(jié)果及陽性面積統(tǒng)計顯示，模型組細(xì)小氣管周圍、血管周圍、肺間質(zhì)和總分的評分明顯高于正常組，模型組陽性面積明顯大于正常組（P＜0.01），給予化痰活血方和梓醇干預(yù)后，可不同程度的降低細(xì)小氣管周圍、血管周圍、肺間質(zhì)和總分的評分和陽性面積的百分比；
　　4.模型組的白細(xì)胞總數(shù)明顯高于正常組，其中單核細(xì)胞數(shù)最多；模型組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)明顯增加，與

7、正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；化痰活血方和梓醇干預(yù)后，BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05或P＜0.01）；
　　5.模型組小鼠BALF中白介素5（IL-5）、MUC5AC含量明顯高于正常組，給予化痰活血方和梓醇干預(yù)后，IL-5、MUC5AC在BALF中的含量均不同程度的下降；哮喘模型組小鼠BALF中表介素10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）含量明顯低于正常組，給予化痰

8、活血方和梓醇干預(yù)后，IL-10和TGF-β1在BALF中的含量均不同程度的上升（P＜0.05或P＜0.01）；
　　6.梓醇（0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、300μM）對刺激劑EGF誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞株增殖活性沒有影響；
　　7.梓醇（3μM、10μM、30μM）對刺激劑 EGF誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞株上清液中的MUC5AC有一定抑制作用（P＜0.01）；
　　結(jié)論：
　　1.通過動

9、物整體狀況、哮喘潛伏期、HE染色和PAS染色的分析，本實驗成功建立哮喘模型；
　　2.化痰活血方和梓醇可以降低哮喘模型小鼠 BALF中白細(xì)胞總數(shù)含量和炎性細(xì)胞數(shù)量如嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的含量；
　　3.化痰活血方和梓醇可以降低哮喘模型小鼠氣道阻力RI值；
　　4.化痰活血方和梓醇可以緩解哮喘小鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤、基底膜增厚、黏蛋白高分泌和杯狀細(xì)胞增生的癥狀；
　　5.化痰活血方和梓醇可以降低IL

10、-5、MUC5AC在哮喘小鼠BALF中的含量，升高IL-10和TGF-β1在哮喘小鼠BALF中的含量；
　　6.化痰活血方和梓醇對哮喘小鼠炎癥和黏蛋白MUC5AC有一定的抑制作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)控炎癥細(xì)胞和調(diào)節(jié)性因子而發(fā)揮作用；
　　7.梓醇（0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、300μM）對16HBE細(xì)胞株增殖活性沒有影響；
　　8.梓醇（3μM、10μM、30μM）對刺激劑 EGF誘導(dǎo)的