細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞黏蛋白和PTEN的表達(dá)及其意義.pdf

1、研究背景:呼吸道黏液是氣道防御屏障的重要組成部分,在維持氣道濕化、協(xié)助上皮細(xì)胞功能等方面起重要作用.但如果黏液過度分泌,可阻塞呼吸道導(dǎo)致嚴(yán)重的氣流受限,這種狀況常發(fā)生在許多嚴(yán)重的呼吸道疾病中,包括支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstruction pulmonary disease,COPD),與這些疾病的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有密切關(guān)系.氣道黏液包括糖蛋白、非糖蛋白類蛋白質(zhì)、脂、無機鹽、水等成分組成,高度糖基化的黏蛋白是氣道

2、黏液的最主要成分,痰液的黏性也由黏蛋白賦予.不論是健康個體還是氣道疾病的患者,氣道分泌的黏液中MUC5AC是最主要的黏蛋白成分,其后依次為MUC5B和MUC2.進(jìn)一步研究氣道黏蛋白表達(dá)的調(diào)控,將有助于更好了解慢性氣道炎癥黏液高分泌機制,為慢性氣道炎癥性疾病防治提供新的方向. 細(xì)菌感染是氣道黏液高分泌的常見因素,研究表明革蘭氏陰性細(xì)菌及其胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)可以通過表皮生長因子受體(epider

3、malgrowth factor receptor,EGFR)及其下游絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)信號通路上調(diào)氣道MUC5AC、MUC2的表達(dá),但目前對L,PS是否上調(diào)氣道上皮細(xì)胞MUC5B的表達(dá)尚未明確,為此我們在研究LPS上調(diào)氣道MUC5AC、MUC2表達(dá)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討LPS對氣道上皮細(xì)胞MUC5B表達(dá)的影響. 第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

4、基因(phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome 10,PTEN)是1997年發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的抑癌基因.其產(chǎn)物.PTEN蛋白在人的上皮細(xì)胞有豐富的表達(dá).其對磷酸化的酪氨酸和絲/蘇氨酸殘基均有去磷酸化作用,是一種雙特異性磷酸酶,它的底物還包括磷脂,該酶對P13K/AKT(磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)途徑和MAPK途徑均起負(fù)向調(diào)節(jié)作用.最新研究表明,PTEN

5、可以下調(diào)香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞黏蛋白MUC5AC的高表達(dá),由于LPS與香煙煙霧均通過EGFR-MAPK信號通路上調(diào)粘蛋白的表達(dá),所以我們設(shè)想PTEN也在LPS誘導(dǎo)的氣道上皮黏蛋白表達(dá)中具有重要作用.我們采用NCI-H292細(xì)胞,給予銅綠假單胞菌脂多糖(pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharides,PA-LPS)干預(yù)細(xì)胞,檢測三種主要氣道黏蛋白mRNA及蛋白的表達(dá)情況,同時檢測PTEN mRNA

6、及蛋白的表達(dá),分析兩者的相關(guān)性,探討PTEN在LPS誘導(dǎo)氣道上皮黏蛋白表達(dá)中的意義. 研究目的：觀察PA-LPS刺激人氣道黏液上皮NCI-H292細(xì)胞后MUC5AC、MUC5B、MUC2和PTEN的mRNA表達(dá)情況,同時在蛋白水平檢測黏蛋白和PTEN表達(dá),分析黏蛋白和PTEN表達(dá)的相關(guān)性,探討PA-LPS對人氣道上皮黏蛋白表達(dá)的影響及PTEN在LPS誘導(dǎo)黏蛋白表達(dá)中的意義. 研究方法：培養(yǎng)人氣道黏液上皮癌細(xì)胞系NCI-H

7、292細(xì)胞,用PA-LPS干預(yù)細(xì)胞,干預(yù)24小時后抽取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(reversetrancription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法檢測MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA和MUC2 mRNA的表達(dá),采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞中MUC5AC、MUC2蛋白的表達(dá).同樣的方法從mRNA水平和蛋白水平檢測PTEN的表達(dá),分析三種黏蛋白mRNA和PTEN mRNA

8、表達(dá)的相關(guān)性. 研究結(jié)果： 1.干預(yù)后MUC5AC、MUC5B以及MUC2的mRNA表達(dá)水平變化: 1.1 RT-PCR結(jié)果顯示,LPS干預(yù)組MUC5AC mRNA表達(dá)與對照組相比明顯增加,差異有顯著性(p<0.01). 1.2 RT-PCR結(jié)果顯示,LPS干預(yù)組MUC5B mRNA表達(dá)與對照組相比明顯增加,差異有顯著性(p<0.05). 1.3 RT-PCR結(jié)果顯示,LPS干預(yù)組MUC2 mRN

9、A表達(dá)與對照組相比明顯增加,差異有顯著性(p<0.05). 2.干預(yù)后PTEN的mRNA表達(dá)水平變化: RT-PCR結(jié)果顯示,LPS干預(yù)組PTEN mRNA表達(dá)與對照組相比明顯減少,差異有顯著性(p<0.01).3.干預(yù)后MUCfAC以及MUC2蛋白水平變化:3.1培養(yǎng)細(xì)胞爬片免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MUC5AC結(jié)果提示,MUC5AC蛋白表達(dá)于胞漿中,陽性細(xì)胞胞漿染色呈黃褐色,對照組僅少數(shù)細(xì)胞胞漿著色,LPS干預(yù)后細(xì)胞MUCSA

10、C染色明顯增強呈陽性,陽性細(xì)胞百分率與對照組相比具有顯著性差異(p<0.01).3.2培養(yǎng)細(xì)胞爬片免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MUC2結(jié)果提示,MUC2蛋白表達(dá)于胞漿中,陽性細(xì)胞胞漿染色呈黃褐色,對照組細(xì)胞僅少數(shù)呈陽性著色,LPS干預(yù)后細(xì)胞MUC2染色明顯增強呈陽性,陽性細(xì)胞百分率與對照組相比具有顯著性差異(p<0.01).4.干預(yù)后PTEN蛋白水平變化: PTEN蛋白主要陽性染色位于胞漿中,極少數(shù)位于胞核和胞膜,陽性染色呈黃褐色,對照組細(xì)

11、胞染色呈陽性,LPS干預(yù)后細(xì)胞PTEN陽性染色明顯減弱,陽性細(xì)胞百分率與對照組相比具有顯著性差異(p<0.01).5.MUCfAC、MUCSB以及MUC2的mRNA表達(dá)水平與PTEN mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析: 細(xì)胞中MUC5AC mRNA表達(dá)水平與PTEN mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r值為-0.632、p<0.05).MUC5B以及MUC2的mRNA表達(dá)水平與PTEN mRNA表達(dá)無明顯相關(guān)性(r值分別為-0.398、-0.2