人氣道上皮細胞抗菌肽hBD-2誘導表達的信號途徑及影響.pdf

1、內源性抗菌肽(Endogenousantibioticpeptides)是動、植物天然免疫的重要介質，在哺乳動物(包括人)中，由于對革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌、螺旋體、分枝桿菌及某些包膜病毒等有很強殺傷活性，故將其命名為防御素(defensin)。迄今為止，在人體中已發(fā)現的防御素共有三類(α、β、θ)。其中β防御素家族共發(fā)現28種。研究表明人β防御素-2(Humanβ-defensin-2，hBD-2)是粘膜和上皮細胞抵抗微生物入侵的重

2、要介質，在持續(xù)暴露在病原微生物的器官(皮膚、臟器等)粘膜表面發(fā)揮重要的抗菌作用，是第一個發(fā)現的可誘導表達的抗菌肽，它不僅具有廣譜抗微生物活性，而且在先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用，起著連接先天性免疫和獲得性免疫的橋梁作用。因此hBD-2在治療肺部感染性疾病、皮膚病中具有廣泛的應用前景。臨床治療呼吸道感染性疾病工作中，細菌對傳統的抗生素的耐藥己成為當今治療呼吸道感染疾病面臨的難題，應當從新的角度研發(fā)抗感染藥物，作為內源性抗菌肽的代

3、表hBD-2是當今研究的焦點。但hBD-2作為一種新型抗菌物質使用于臨床進行開發(fā)，目前遇到很大困難，例如：人工合成造價極其昂貴；通過基因工程技術生產也面臨許多難題等。因此，本實驗通過選用肺炎鏈球菌、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)及TNF-α刺激人原代支氣管上皮細胞(humanbronchialepithelialcells，HBECs)，檢測hBD-2表達；凝膠遷移率法(EMSA)及激光共聚焦顯微鏡技術檢測hBD

4、-2表達時NF-кB活性、類型及細胞內鈣離子濃度([Ca2+]in)的變化；以及用不同的鈣調節(jié)劑(EGTA、BAPTA-AM、肝素及ATP)與TNF-α聯合作用于細胞，對hBD-2mRNA表達、NF-кB活性及[Ca2+]in的影響，旨在闡明人氣道上皮細胞hBD-2表達的信號轉導途徑及影響因素，探討hBD-2可誘導表達機制，為通過人工誘導方法增強內源性hBD-2表達發(fā)揮其藥理抗菌活性治療呼吸道感染及解決細菌耐藥問題提供實驗依據。

5、 方法 1.采用人肺葉或肺段支氣管，用蛋白酶ⅩⅣ消化加機械刮刷法分離上皮細胞，用添加必需營養(yǎng)因子的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基，體外原代培養(yǎng)HBECs，并用細胞角蛋白作免疫細胞化學鑒定培養(yǎng)的HBECs。 2.RT-PCR、免疫細胞化學和Westernblotting法檢測肺炎鏈球菌、TNF-α及LPS刺激培養(yǎng)HBECs的hBD-2表達。 3.EMSA檢測TNF-α誘導HBECshBD-2表達時NF-кB活性及亞型

6、變化；RT-PCR檢測NF-кB抑制劑PDTC對TNF-α誘導HBECshBD-2mRNA表達的影響。 4.激光掃描共聚焦顯微鏡技術檢測TNF-α刺激人HBECs時[Ca2+]in變化情況；用細胞內鈣鰲合劑(BAPTA-AM)、細胞外鈣鰲合劑(EGTA)及IP3受體拮抗劑(肝素)與TNF-α聯合作用于細胞，RT-PCR檢測hBD-2mRNA表達；EMSA檢測NF-кB活性的變化；激光掃描共聚焦顯微鏡技術檢測[Ca2+]in變化。

7、 5.用鈣非特異性調節(jié)劑ATP作用于HBECs，檢測[Ca2+]in、NF-KB活性及hBD-2mRNA表達變化情況。 結果 1.以人肺葉或肺段支氣管為取材對象，用添加營養(yǎng)因子的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基成功培養(yǎng)了HBECs。 2.不同質量濃度的肺炎鏈球菌(0.001cfu/ml、0.01cfu/ml、0.1cfu/ml、1cfu/ml、10×107cfu/ml)、TNF-α(1ng/ml、10ng/m

8、l、100ng/ml、1000ng/ml)及LPS(0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L)刺激HBECs3h后，hBD-2mRNA表達呈劑量依賴性升高，與對照組差異顯著(p＜0.01、0.01、0.01)。 3.一定濃度的肺炎鏈球菌(0.1×107cfu/ml)、TNF-α(10ng/ml)及LPS(0.1mg/L)刺激培養(yǎng)的HBECs，(1)1.5-3h后可見hBD-2mRNA表達，并持續(xù)24h；(2)2

9、-4h后免疫細胞化學證實HBECs胞漿hBD-2蛋白表達；(3)2-4h后免疫印跡證實HBECs裂解液中含有hBD-2蛋白。 4.P65/P50型NF-кB異二聚體激活參與了TNF-α誘導HBECs的hBD-2表達，TNF-α在一定濃度范圍內(0.1ng/ml-1000ng/ml)與NF-кB活性增高呈劑量依賴性關系；NF-кB抑制劑PDTC可抑制TNF-α誘導HBECs的hBD-2mRNA表達。 5.一定濃度的TNF-

10、α(10ng/ml)刺激HBECs可使[Ca2+]in增高；細胞外鈣鰲合劑(EGTA)不能抑制TNF-α誘導的[Ca2+]in增高，對NF-кB活性增高及hBD-2mRNA表達增高無影響(p＞0.05、0.05)；細胞內鈣鰲合劑(BAPTA-AM)及IP3受體拮抗劑(肝素)可抑制TNF-α誘導的NF-кB活性及hBD-2mRNA表達(p＜0.01、0.01；p＜0.01、0.01)。 6.ATP在一定濃度范圍內(40-100μM

11、)可使HBECs內鈣離子濃度短暫性增高；一定濃度ATP(100μM)刺激HBECs3h后NF-кB活性增高，刺激6h后可見hBD-2mRNA表達(p＜0.01)，但在時間上明顯滯后于TNF-α所致的NF-кB活化增高及hBD-2mRNA表達。 結論 1.本實驗成功培養(yǎng)了HBECs。 2.本實驗證實了肺炎鏈球菌、TNF-α及LPS作用人HBECs可誘導hBD-2表達，hBD-2的表達及分泌可能是氣道最初防御反應，與

12、細胞因子組成網絡系統，發(fā)揮防御病原微生物及免疫作用。 3.P65/P50型NF-кB異二聚體激活參與了TNF-α誘導人氣道上皮細胞hBD-2的表達；NF-кB是HBECs表達hBD-2必需的核轉錄因子。 4.TNF-α誘導HBECs表達hBD-2是通過[Ca2+]in增高致NF-кB激活實現的；胞內鈣離子濃度增高機制是激活細胞內IP3受體敏感性鈣通道使鈣庫中鈣離子釋放至胞漿所致。 5.鈣非特異性調節(jié)劑ATP可誘導

13、HBECsNF-кB活化及hBD-2mRNA表達，但時間較TNF-α誘導NF-кB活化、hBD-2mRNA表達滯后。 綜上述，一定濃度的肺炎鏈球菌、TNF-α及LPS可誘導HBECs表達hBD-2；鈣非特異性調節(jié)劑ATP也可誘導HBECs表達hBD-2mRNA，但具有滯后性；細胞內鈣濃度增高致NF-кB信號通路激活介導了TNF-α誘導人氣道上皮細胞hBD-2基因的轉錄。上述實驗為臨床實際工作中通過人工誘導方法增強內源性hBD-2