家蠅抗菌肽的誘導(dǎo)、分離純化及體內(nèi)外抗菌活性研究.pdf

1、背景介紹： 抗菌肽(antibacterial peptides)是固有性免疫的效應(yīng)分子，是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的多肽。到現(xiàn)在為止，已發(fā)現(xiàn)抗菌肽廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)。抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、無免疫原性和抗菌譜廣的特點。除非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體外，還有抗腫瘤細(xì)胞的作用，特別是對多重耐藥菌和腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，而不破壞人體的正常細(xì)胞，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕?/p>

2、，是目前抗病原微生物藥物開發(fā)研究中的一個熱點。 目的： 誘導(dǎo)和分離純化家蠅(Musca，domestica)幼蟲免疫血淋巴中的抗菌肽，研究抗菌肽的性質(zhì)和抑菌特性，觀察抗菌肽對銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌感染小鼠創(chuàng)面的抗菌作用，為進(jìn)一步研究家蠅幼蟲抗菌肽的制備及應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。 方法： 1.家蠅及幼蟲養(yǎng)殖是提取抗菌肽的前提條件，經(jīng)過反復(fù)試驗建立穩(wěn)定的室內(nèi)養(yǎng)殖方法和條件。 2.通過超聲處理誘導(dǎo)家蠅幼蟲產(chǎn)

3、生免疫血淋巴，經(jīng)沸水浴熱變性，結(jié)合高速離心，兩步CM-Sepharose離子交換層析，冷凍干燥濃縮等步驟，分離得到一種具抗菌活性的蛋白質(zhì)。用Tricine SDS-PAGE鑒定抗菌肽的純度和性質(zhì)，抑菌試驗分析抗菌肽的抑菌特性。 3.取ICR小鼠40只，切除背部全層皮膚(創(chuàng)面為1cm×1cm)，其中l(wèi)0只作為無菌對照，另30只創(chuàng)面涂抹銅綠假單胞菌菌液作為感染模型，隨機(jī)分為對照組，磺胺米隆組和抗菌肽組。傷后2h和每天分別用等滲生理鹽

4、水、100g/L的磺胺米隆、0.1g/L抗菌肽濾紙濕敷，傷前和傷后3天抽血觀察白細(xì)胞變化；觀察小鼠重量的變化和14天后的存活率。 4.取ICR小鼠30只，切除背部1cm×1cm全層皮膚，涂抹陰溝腸桿菌菌液作為感染模型，隨機(jī)分為3組。傷后2h和每天各組分別用等滲生理鹽水、100g/L的磺胺米隆或0.1g/L抗菌肽濾紙濕敷，傷前和傷后3天抽血觀察白細(xì)胞變化；傷后3天痂下肌肉組織細(xì)菌定量和計算存活率。 結(jié)果： 1.家蠅

5、正常生長需要一定的光照時間和充足的營養(yǎng)。家蠅生長的適宜溫度為25℃～35℃，相對濕度宜保持在60％～70％。幼蟲生長發(fā)育的溫度通常是22℃～36℃，最佳溫度是26℃，要求充足的養(yǎng)料，含水量50％～60％最適宜，可接受少量光照。 2.300W，50Hz超聲處理60s能夠誘導(dǎo)家蠅幼蟲產(chǎn)生抗菌肽，經(jīng)分離純化后Tricine SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果顯示為一條帶，相對分子量大約為5 800。純化蛋白對陰溝腸桿菌，銅綠假單桿菌等G￣桿菌的抑菌

6、活性較強(qiáng)，而對G+金黃色葡萄球菌效果不顯著。 3.對銅綠假單胞菌感染的ICR小鼠的試驗發(fā)現(xiàn)對照組小鼠相比其它兩組活動減少，術(shù)后三組白細(xì)胞計數(shù)均減少。14天后對照組存活率為30％，明顯少于磺胺米隆組90％(P＜0.05)和抗菌肽組80％(P＜0.05)。對照組小鼠的重量在第6天開始下降，明顯少于其它兩組(P＜0.05)。而無菌對照組無死亡，重量持續(xù)增加。 4.對陰溝腸桿菌感染的ICR小鼠創(chuàng)面的試驗發(fā)現(xiàn)術(shù)后3組白細(xì)胞計數(shù)均減

7、少，對照組顯著低于其它兩組(P＜0.05)；痂下肌肉組織細(xì)菌定量抗菌肽組(99±32)×10 2 CFU/g和磺胺米隆組(87±31)×10 2 CFU/g，均顯著低于對照組(504+338)×10 3 CFU/g(P0.01)；對照組術(shù)后3天存活率明顯少于其它兩組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.建立了可培育發(fā)育正常的家蠅及蠅幼蟲條件。 2.誘導(dǎo)和純化了一種對G￣桿菌有較高抗菌活性的家蠅幼蟲抗菌肽，為此類活性物質(zhì)