家蠅天然抗菌肽的純化和天蠶素的重組表達(dá)與活性分析.pdf

1、昆蟲是生物界分布最廣泛也是最為龐大的一個(gè)類群,其多樣性是生物多樣性的一個(gè)典型代表.昆蟲抗菌肽的發(fā)現(xiàn)使人們逐漸了解到昆蟲及其它無脊椎動(dòng)物的先天免疫機(jī)制,并且認(rèn)識(shí)到抗菌肽在機(jī)體防御中的重要作用.迄今為止,已經(jīng)從植物、昆蟲、蝦、貝、兩棲動(dòng)物和哺乳動(dòng)物如人和小鼠等生物中發(fā)現(xiàn)了800多種抗菌肽.抗菌肽是一類分子量低(3.0-5.0kD)、水溶性好、對(duì)熱穩(wěn)定、強(qiáng)堿性的肽類,具有廣譜抗細(xì)菌活性,而且還對(duì)真菌、病毒、原生生物包括寄生蟲和某些腫瘤細(xì)胞具有

2、很強(qiáng)的殺傷能力.由于抗菌肽作用于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜而殺死細(xì)菌的獨(dú)特的作用機(jī)制,使得病原微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗性,因此,對(duì)抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能的研究有望開發(fā)出新型的可抗耐藥菌的藥物.基于此,我們選取了易于取材和人工飼養(yǎng)、繁殖周期短的家蠅為試驗(yàn)材料,開展了兩個(gè)方面的工作.1、構(gòu)建了家蠅天蠶素基因Md145成熟肽的畢赤酵母重組表達(dá)載體,篩選到了多拷貝的陽性克隆,并在酵母中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá).通過Tricine-聚丙烯酰胺凝膠電泳在預(yù)期的位置檢測(cè)到了目的蛋白的

3、表達(dá),Bradford法檢測(cè)第五天表達(dá)上清中的總蛋白產(chǎn)量是100mg·L<'-1>,管碟法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物抑菌活性的結(jié)果顯示,表達(dá)上清對(duì)Gram<'->、Gram<'+>有較強(qiáng)的抗菌活性,且對(duì)熱穩(wěn)定,100℃加熱20分鐘仍然有活性.但存在的問題是表達(dá)量不高,而且表達(dá)不穩(wěn)定,不利于規(guī)模生產(chǎn)、分離純化和抗菌譜分析.同時(shí),我們還構(gòu)建了該基因的三拷貝酵母胞內(nèi)表達(dá)型載體,并轉(zhuǎn)化了畢赤酵母KM71.這一部分工作有待進(jìn)一步的深入和探索.2、用大腸桿菌和金

4、黃色葡萄球菌混合液(OD<,600>=0.18)刺激家蠅二齡幼蟲,48小時(shí)以后取其血淋巴.將無細(xì)胞的血淋巴酸化以后直接上Sep-Pak C<,18>柱進(jìn)行固相萃取,分別以10﹪、30﹪和80﹪濃度的ACN洗脫,將各洗脫組分真空抽干,以管碟法檢測(cè)抑菌活性.現(xiàn)已檢測(cè)到三個(gè)梯度SPE組分對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有很強(qiáng)的抑制作用.對(duì)10﹪的固相萃取組分利用RP-HPLC進(jìn)行了純化.利用液體生長(zhǎng)抑制法發(fā)現(xiàn)其中四個(gè)組分有很強(qiáng)的抑菌活性.通過這部