轉錄因子NF-E2相關因子在砷誘導的人類HaCaT細胞抗氧化反應和細胞毒性中作用的研究.pdf

1、前言：
　　 砷是一種廣泛存在的環(huán)境毒物,可以誘導細胞產(chǎn)生氧化應激反應,包括無機砷和有機砷。人類砷暴露主要是飲用含砷的地下水源或者醫(yī)用含砷藥物導致。砷是法醫(yī)學實踐中經(jīng)常涉及的一種毒物,由于急性砷中毒的癥狀不明顯或慢性砷中毒的毒物檢出量很低,所以研究砷暴露對人體的損害及其機制也會為砷中毒的法醫(yī)學鑒定提供證據(jù)。當人類長期暴露于無機砷后,會出現(xiàn)多種疾病,包括多臟器腫瘤、高血壓、糖尿病和皮膚損害。砷暴露致皮膚損害的類型包括良性的皮膚色素

2、代謝異常和皮膚過度角化,惡性病變包括皮膚Bowen氏病和皮膚的惡性腫瘤。盡管砷是明確的皮膚毒物,但砷致皮膚損害的機制尚不清楚。前期的研究表明砷可以誘導細胞發(fā)生氧化應激反應并可導致氧化性DNA損傷。因此砷致皮膚損害的機制很可能與細胞的氧化應激反應有關。轉錄因子NF-E2相關因子是CNC家族成員之一,包括NRF1、NRF2和NRF3,這些轉錄因子在細胞氧化應激反應引發(fā)的細胞適應性變化過程中發(fā)揮重要作用。因此,本研究旨在探討NRFs在砷致體外

3、培養(yǎng)的HaCaT細胞抗氧化反應和細胞毒性中的作用及其機制,從而闡明砷致皮膚損害的機制,為預防和治療砷致皮膚過度角化和皮肽癌提供理論依據(jù),同時探討NRFs在法醫(yī)學實踐中鑒定砷中毒的應用價值。
　　 方法：
　　 本實驗應用慢病毒為載體的sh-RNA,在體外培養(yǎng)的HaCaT細胞中制作NRF1、NRF2、NRF3和KEAP1選擇性基因沉默(knockdown,KD)的細胞模型,應用qRealtime RT-PCR和Wester

4、n blotting技術觀察砷暴露條件下NRFs、KEAP1和一系列ARE目的基因表達,觀察選擇性基因沉默的細胞內(nèi)ARE目的基因表達的變化,探討NRFs的激活機制和對ARE目的基因的調(diào)控作用,同時應用MTT方法和流式細胞儀技術檢測選擇性基因沉默的細胞對砷誘導的細胞毒性的反應變化,從而闡明NRFs在砷誘導的細胞抗氧化反應過程中的作用。此外,應用熒光素酶活性檢測試劑(Luciferase Activity)觀察砷對HaCaT細胞內(nèi)的ARE活

5、性的影響。
　　 結果：
　　 流行病學調(diào)查結果表明慢性砷暴露導致的典型皮膚病理學改變有助于法醫(yī)學實踐中判定慢性砷中毒。MTT和流式細胞儀結果顯示,在體外培養(yǎng)的HaCaT細胞內(nèi),NRF2的沉默明顯增強砷誘導的細胞毒性,KEAP1是NRF2的抑制因子,該分子沉默的細胞表現(xiàn)出明顯拮抗效應。然而,NRF1的沉默也可以增強細胞對砷誘導的細胞毒性的敏感性,但其程度較NRF2沉默的細胞弱。NRF3的基因沉默細胞對砷誘導的細胞毒性沒有

6、明顯變化。為了探討其機制,在砷暴露的條件下,我們對NRFs的表達和一系列氧化應激反應相關基因,如NQO1、GCLC、GCLM、HMOX-1、SRX等基因進行檢測。實驗結果表明砷和其他的NRF2的激活因子(如tBHO和Sulforaphane)不同,砷不僅可以激活NRF2還可以激活NRF1的表達,而且存在明顯的時間和劑量效應。NRF1是在細胞內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)發(fā)生糖基化的蛋白。糖基化的過程明顯影響砷對ARE活性的激活。砷可以激活NRF1并引起NRF

7、1的核內(nèi)聚集,實驗結果還顯示過糖基化和非糖基化的蛋白仍可以轉錄到核內(nèi)。NRF1在細胞內(nèi)通過調(diào)控GCLC和GCLM的表達而影響細胞內(nèi)GSH水平,另外NRF1還可以調(diào)控NQO1的表達,但NRF1對細胞內(nèi)HMOX-1的表達幾乎沒有影響。砷暴露對NRF2的激活作用很明顯,低劑量的砷即可激活細胞內(nèi)NRF2的表達,而且NRF2可調(diào)控細胞內(nèi)NQO1、HMOX-1、GCLC、GCLM和SRX等ARE基因的表達,從而對砷誘導的細胞毒性產(chǎn)生細胞保護作用。K

8、EAP1作為NRF2的負性調(diào)節(jié)因子,其沉默后在正常生理狀態(tài)下,上調(diào)NRF2的表達并調(diào)控ARE相關基因的表達增強,但該分子的沉默并不能導致砷誘導的細胞內(nèi)ARE相關基因表達的進一步增加,說明KEAP1對NRF2的調(diào)控作用非常顯著。值得提出的是KEAP1的沉默可下調(diào)細胞內(nèi)HMOX-1的表達,說明細胞內(nèi)HMOX-1表達的調(diào)控存在復雜的機制。砷暴露可導致NRF3的基因表達變化,但NRF3的基因沉默并未引起細胞對砷誘導的細胞毒性和抗氧化反應的異常,

9、而且NRF3對ARE目的基因的表達基本沒有調(diào)控作用。在我們針對選擇性基因沉默細胞的研究發(fā)現(xiàn),NRFs和KEAP1之間存在復雜的相互作用和調(diào)控機制。在三價無機砷暴露的情況下,NRF1的沉默并不影響細胞內(nèi)NRF2的表達水平,但在該細胞內(nèi),NRF3的基因表達水平上調(diào),而KEAP1的表達水平下調(diào),說明NRF1和KEAP1很可能存在相互作用。在NRF2選擇性沉默的細胞內(nèi),NRF1的蛋白水平和NRF3的基因表達均上調(diào),KEAP1的表達下調(diào),說明NR

10、F1和NRF3在砷暴露下可以彌補NRF2沉默導致的功能障礙,而且NRF2和KEAP1存在結合和相互調(diào)控。KEAP1基因的沉默導致細胞內(nèi)NRF2蛋白表達水平的上調(diào),尤其是細胞核內(nèi)的聚集,但該分子的沉默卻導致了NRF1蛋白表達的下調(diào),說明NRF1和NRF2存在競爭性結合ARE位點的作用機制,而且進一步確定了NRF1和KEAP1之間可能存在相互結合。NRF3基因的沉默不影響細胞內(nèi)NRF1、NRF2和KEAP1的表達水平。說明NRF3可能是一種

11、相對獨立的轉錄因子。另外,我們使用了多種化合物和重金屬毒物,發(fā)現(xiàn)只有砷可以激活NRF1。
　　 結論：
　　 1.砷可以激活NRF1和NRF2,其蛋白表達并且存在時間和劑量依賴性;2.NRF1和NRF2在砷誘導的細胞毒性中發(fā)揮保護性作用;3.NRF1可以調(diào)控細胞內(nèi)GCLC、GCLM、SRX和NQO1的表達水平,NRF2不僅調(diào)控上述基因,對HMOX-1的調(diào)控作用也很明顯。NRF2在調(diào)控ARE相關基因的作用比NRF1強;4.

12、KEAP1的沉默在正常生理狀態(tài)下即可導致NRF2的蛋白聚集及NRF2調(diào)控的ARE目的基因的表達,增強包括GCLC、GCLM、SRX、NQO1的表達,但在砷誘導的情況下,KEAP1的沉默并不能進一步增高砷導致的ARE目的基因的增高;5.NRFs和KEAP1之間的相互作用:(1)NRF1和NRF3可以彌補NRF2的沉默,而NRF2不能彌補NRF1的沉默;(2)NRF1和NRF2的沉默導致KEAP1的表達下降。(3)KEAP1的沉默導致NRF