ATF2與炎性因子在砷誘導(dǎo)人正常膀胱上皮細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)因子表達(dá)中的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人正常膀胱上皮細(xì)胞IL8、TNFα、TGFα和TGFβ1的水平，檢測(cè)職業(yè)砷暴露工人尿中砷化物、IL8、TNFα和TGFα的水平，分析它們之間的關(guān)系，了解砷暴露對(duì)炎性因子IL8、TNFα、TGFα和TGFβ1分泌的影響，進(jìn)而驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的推斷，探尋砷致膀胱損傷的生物標(biāo)記物，為研究砷致膀胱癌的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　一、研究對(duì)象
　　在遼寧省某銅礦冶煉廠選取72名男

2、性一線工人，受試者無(wú)炎癥和心臟、肝、腎等器官功能障礙以及其他惡性疾病。
　　二、通過(guò)對(duì)尿液樣品采集，進(jìn)行尿形態(tài)砷測(cè)定、尿肌酐測(cè)定、細(xì)胞培養(yǎng)與砷處理、細(xì)胞活力測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)NT水平檢測(cè)等內(nèi)容進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　一、職業(yè)砷暴露人群尿砷含量與砷甲基化代謝能力的比較
　　尿總砷高于50μg/g Cr組工人尿中iAs、MMA、DMA和TAs四種形態(tài)砷化物顯著高于尿總砷低于50μg/g Cr組，兩組間的砷甲基化代謝

3、能力無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　二、職業(yè)砷暴露人群尿炎性因子含量的分析
　　尿總砷高于50μg/g Cr組工人尿IL8、TNFα和TGFα水平均高于尿總砷低于50μg/g Cr組。
　　三、職業(yè)砷暴露人群尿中IL8、TNFα和TGFα濃度與尿砷化物及機(jī)體砷甲基化代謝能力的關(guān)系
　　尿中IL8濃度與iAs、iAs％顯著正相關(guān)，與PMI顯著負(fù)相關(guān);尿中TNFα濃度與iAs、DMA的含量顯著正相關(guān);TGFα與DMA、TAs的含

4、量顯著正相關(guān)。
　　采用多元線性回歸模型進(jìn)一步探討影響尿中IL8、TNFα和TGFα含量的因素?？刂屏四挲g、工齡、BMI、血壓、吸煙和飲酒情況、近3日海產(chǎn)品和含牛黃類藥物的攝入情況等因素后，影響尿中IL8水平的因素有尿中iAs、MMA濃度，影響尿中TNFα水平的因素有iAs、SMI，影響尿中TGFα水平的因素有iAs、SMI和年齡。
　　四、亞砷酸鈉對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞活力的影響
　　細(xì)胞經(jīng)0、0.5、1、2、4、8

5、、10和20μmol/L NaAsO2染毒處理24 h后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力，各砷處理組細(xì)胞活力分別與對(duì)照組比較。各劑量NaAsO2染毒組細(xì)胞活力均低于對(duì)照組，且染毒劑量越高活力越低，呈現(xiàn)顯著的劑量反應(yīng)關(guān)系。當(dāng)染毒濃度達(dá)到8μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力已降至80％以下。
　　五、亞砷酸鈉對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響
　　0～10μmol/L的NaAsO2染毒處理SV-HUC-1細(xì)胞24 h后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)

6、胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，代表ROS水平。隨NaAsO2濃度的增高，SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，呈現(xiàn)顯著的劑量反應(yīng)關(guān)系，且4、8和10μmol/L NaAsO2染毒組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著高于對(duì)照組。
　　六、亞砷酸鈉對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞內(nèi)NT水平的影響
　　當(dāng)NaAsO2濃度達(dá)到10μmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)NT水平顯著高于對(duì)照組。
　　七、亞砷酸鈉對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞周期的影響
　　采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，與

7、對(duì)照組相比，4μmol/L NaAsO2組G0/G1期細(xì)胞所占比例顯著下降，而G2/M期細(xì)胞比例顯著增多。說(shuō)明4μmol/LNaAsO2處理劑量能縮短細(xì)胞的G0/G1期，進(jìn)而加速細(xì)胞周期。
　　八、亞砷酸鈉誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞ATF2表達(dá)增加
　　SV-HUC-1細(xì)胞在2，4，8和10μmol/L NaAsO2處理下，ATF2 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加。ATF2 mRNA在4μmol/L NaAsO2處理24 h表達(dá)最

8、強(qiáng)。
　　九、BSO、MEL對(duì)砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞ATF2表達(dá)的影響
　　褪黑素MEL顯著抑制砷誘導(dǎo)的ATF2 mRNA水平升高，而巰基耗竭劑BSO增強(qiáng)砷誘導(dǎo)的ATF2 mRNA水平升高。Western blot獲得的ATF2、p-ATF2蛋白表達(dá)結(jié)果與mRNA結(jié)果相一致。
　　十、JNK和p38對(duì)砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞ATF2表達(dá)的影響
　　JNK抑制劑SP600125（10μmol/L）和p38抑制

9、劑SB203580(10μmol/L)抑制劑顯著抑制砷誘導(dǎo)的ATF2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　十一、BSO和MEL對(duì)砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞JNK和p38通路影響
　　抗氧化劑褪黑素顯著抑制砷誘導(dǎo)的JNK和p38蛋白磷酸化水平的升高，而巰基耗竭劑BSO顯著增強(qiáng)砷誘導(dǎo)的JNK和p38蛋白磷酸化水平的升高。
　　十二、NaAsO2誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞IL8、TNFα和TGFαmRNA和蛋白表達(dá)
　　SV-

10、HUC-1細(xì)胞經(jīng)NaAsO2（0、1、2、4、8、10μmol/L）處理24 h后，IL8、TNFα和TGFα mRNA表達(dá)水平顯著增加，同時(shí)，IL8、TGFα和TGFβ1蛋白表達(dá)水平顯著增加。
　　十三、砷對(duì)SV-HUC-1細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響
　　SV-HUC-1細(xì)胞經(jīng)NaAsO2（0、1、2、4、8、10μmol/L）處理24 h后，BCL2、CYCLIND1、COX2、MMP1和PCNA

11、mRNA表達(dá)水平顯著增加，同時(shí)，BCL2、CYCLIND1、COX2、MMP1和PCNA蛋白表達(dá)水平也顯著增加。
　　十四、ATF2在砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)中的作用
　　ATF2基因沉默后能夠降低砷增加的BCL2、CYCLIND1、COX2、PCNA和MMP1 mRNA表達(dá)水平。同時(shí)，ATF2基因沉默后能夠降低砷增加的BCL2、CYCLIND1、COX2蛋白表達(dá)水平。
　　十五、炎

12、性因子IL8在砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)因子表達(dá)中作用
　　IL8中和抗體未能降低砷誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)水平，說(shuō)明IL8沒(méi)有參與砷誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)水平增加。
　　十六、炎性因子IL8在砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞ATF2蛋白表達(dá)中的作用
　　中和炎性因子IL8后，砷誘導(dǎo)的ATF2蛋白表達(dá)水平未發(fā)生改變，說(shuō)明IL8未參與砷誘導(dǎo)的ATF2蛋白表達(dá)水平增加。
　　十七、ATF2在砷誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞炎性

13、因子蛋白和mRNA表達(dá)中的作用
　　ATF2基因沉默后，沒(méi)有降低砷誘導(dǎo)的IL8、TGFα、TGFβ1和TNFα蛋白的表達(dá)水平。同時(shí)，ATF2基因沉默后顯著增加了砷誘導(dǎo)的TGFα和TNFα mRNA的表達(dá)水平，而對(duì)IL8 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論：
　　1、砷可以通過(guò)促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，活化JNK、p38通路，從而誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞ATF2的表達(dá)。
　　2、砷能夠誘導(dǎo)SV-HUC-1細(xì)胞腫瘤發(fā)生相

14、關(guān)因子BCL2、CYCLIND1、COX2、MMP1、PCNA和炎性因子IL8、TNFα、TGFα、TGFβ1 mRNA和蛋白表達(dá)水平增加。
　　3、ATF2參與了砷誘導(dǎo)的SV-HUC-1細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)因子BCL2、CYCLIND1、COX2、PCNA和MMP1的表達(dá)。
　　4、炎性因子IL8未參與砷誘導(dǎo)的SV-HUC-1細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)因子BCL2、CYCLIND1、COX2、PCNA、MMP1和ATF2的表達(dá)。