干細胞分化阻滯以及與腫瘤發(fā)生相關(guān)性研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是存在于骨髓中的一種非造血干細胞,具有自我更新、增殖及多向分化的潛能,在體外可誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、肌肉、脂肪和神經(jīng)等組織細胞。其具有支持造血及免疫調(diào)節(jié)功能,在臨床骨髓移植及移植物抗宿主病防治中具有良好的應(yīng)用價值。腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細胞性質(zhì)的細胞群體,均具有自我更新能力和不

2、定向分化潛能,并可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,現(xiàn)認為腫瘤干細胞是形成不同分化程度腫瘤及其不斷生長的根源。骨髓間充質(zhì)干細胞作為研究最為廣泛的成體干細胞,針對腫瘤干細胞的起源問題,其與腫瘤的關(guān)系也成為了研究的焦點。本文選用大鼠BMSCs作為研究對象,建立大鼠BMSCs向成骨、神經(jīng)細胞分化模型,同時以“成熟阻滯”理論為依據(jù)做一研究,探討干細胞分化受阻與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性。
　　方法：⑴采用全骨髓法分離大鼠BMSCs,并實現(xiàn)體外完全貼壁培養(yǎng)與擴增；⑵根

3、據(jù)BMSCs分化特性,選取第二代生長良好的細胞,分別誘導(dǎo)分化為成骨、神經(jīng)細胞。使用地塞米松、抗壞血酸及β-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)使其分化為成骨細胞,堿性磷酸酶(ALP)表達水平以及分化后期鈣化結(jié)節(jié)的出現(xiàn),通過ALP表達和茜素紅染色來鑒定誘導(dǎo)后的細胞。使用β-巰基乙醇(BME)誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細胞分化,通過免疫組化檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE),神經(jīng)絲蛋白(NF),膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達來鑒定誘導(dǎo)后的細胞；⑶在以上基礎(chǔ)之上

4、,建立分化阻斷模型,探討干細胞與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性:BMSCs分為誘導(dǎo)分化組和分化阻斷組,其中誘導(dǎo)分化組細胞分別向成骨細胞、神經(jīng)細胞正常誘導(dǎo)與此同時分化阻斷組選擇不同的時間點阻斷其正常誘導(dǎo),破壞其正常分化,使其分化受阻而發(fā)生惡變。利用形態(tài)學,免疫組化(神經(jīng)),ALP及茜素紅(成骨),HE染色等方法檢測阻斷后的細胞。通過對正常BMSCs、正常分化的成骨細胞,神經(jīng)細胞以及PC-3細胞作為對照,探討干細胞分化阻斷與腫瘤發(fā)生的相關(guān)性；⑷將分化阻斷

5、后出現(xiàn)異形的細胞進行培養(yǎng),建立軟瓊脂實驗?zāi)Ｐ?進行石蠟切片進行鑒定,初步探討其是否具有克隆形成能力。
　　結(jié)果：①成功分離了大鼠BMSCs并實現(xiàn)體外培養(yǎng),生長狀態(tài)良好,且進一步了解了骨髓間充質(zhì)干細胞的各種生物學特性。②成功誘導(dǎo)大鼠BMSCs向成骨細胞、神經(jīng)細胞分化。誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)了典型的成骨細胞和神經(jīng)細胞形態(tài)學特征,其中成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后的細胞ALP表達活躍,茜素紅染色發(fā)現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)的出現(xiàn);同時神經(jīng)誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后的細胞顯示了神經(jīng)細胞形態(tài)學

6、特征,經(jīng)過免疫組化檢測NSE、NF陽性表達,GFAP陰性表達。③分化受阻后的BMSCs發(fā)生了惡性轉(zhuǎn)變以及部分阻斷點的細胞在軟瓊脂培養(yǎng)中出現(xiàn)克隆,由于細胞阻斷的時間點不同,成骨細胞以及神經(jīng)細胞其特定性表達程度就不同,惡性程度以及克隆形成率也就不同。分化受阻的干細胞分化程度越低,其惡性程度就越高,反之亦然。
　　結(jié)論：干細胞分化過程中的阻斷,使細胞失去正常調(diào)控而停止在分化的某個階段無限增殖,繼而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。通過對干細胞分化阻斷的研究