腦腫瘤干細(xì)胞體外分化研究.pdf

1、第一部分：腦腫瘤干細(xì)胞體外分化的形態(tài)、標(biāo)志物和細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)特征 目的探討腦腫瘤干細(xì)胞(braintumorstemcell,BTSC)在體外分化過程中的細(xì)胞形態(tài)、分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)和增殖動(dòng)力學(xué)變化，為進(jìn)一步研究BTSC分化走向提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法取來自于臨床手術(shù)標(biāo)本(病理診斷為間變性室管膜瘤)的腫瘤干細(xì)胞球(原發(fā)和復(fù)發(fā))，用CDl33免疫磁珠分離出CD133+細(xì)胞，加血清分化，相差顯微鏡下觀察其形態(tài)，在未分化和分化后第

2、3、7、10、21天收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞CD133、Nestin、dFAP、β-TubulinⅢ的表達(dá)。在未分化和分化第7天做增殖周期測(cè)定。取正常神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcell，NSC)作為對(duì)照。 結(jié)果1)形態(tài)：BTSCs由圓形到短梭形和多角形、再到長(zhǎng)梭形及少量星形，第7天以后細(xì)胞形態(tài)往短梭形和圓形回復(fù)，出現(xiàn)細(xì)胞聚集成球重新飄浮在培養(yǎng)基中；NSCs按固有規(guī)律分化：從圓形到多角形和梭形再到星形膠質(zhì)細(xì)胞和長(zhǎng)纖維狀的

3、神經(jīng)元。2)標(biāo)志物：BTSCs和NSCs未分化時(shí)CDl33和Nestin均高表達(dá)，CDl33分別為84.12±1.22％和86.36±1.95％，Nestin分別為80.76±1.83％和78.79±1.67％；BTSCs分化后CDl33和Nestin全程表達(dá)，且先降后升，第7天表達(dá)率分別為3.65±0.17％和28.99±1.26％，第2l天分別為14.63±1.16％和45.46±1.27％；GFAP和β-TubulinⅢ表達(dá)量一直

4、偏低，但GFAP陽性表達(dá)率相對(duì)高于β-TubulinⅢ；NSCs在分化第十天時(shí)失去了CD133和Nestin的表達(dá)，GFAP和β-TubulinⅢ表達(dá)量明顯增加，分別為88.94±1.23％和11.94±0.36％。3)增殖周期及倍體：BTSCs分化前為亞二倍體，分化后有少量二倍體和大量亞二倍體及超二倍體，處于G2-M期和S期的細(xì)胞比例大于NSCs，復(fù)發(fā)BTSCs分化后細(xì)胞組成比原發(fā)BTSCs復(fù)雜；神經(jīng)干細(xì)胞分化前后都為整二倍體，主要處

5、于G0-G1期。 結(jié)論細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志物的表達(dá)、增殖周期及倍體變化反映出腦腫瘤干細(xì)胞分化走向和神經(jīng)干細(xì)胞不同，存在明顯的分化障礙。 第二部分：丙戊酸鈉對(duì)腦腫瘤干細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的體外實(shí)驗(yàn)研究目的探索丙戊酸鈉對(duì)人腦腫瘤干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用，觀察分化相關(guān)標(biāo)志物在分化過程中的表達(dá)。 方法用不同濃度(1.2mmol/L、2.4mmol/L)的丙戊酸鈉(valproate，VPA)在體外含血清和無血清條件下誘導(dǎo)人腦腫瘤干細(xì)胞

6、。誘導(dǎo)分化第7、21天收集細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD133、Nestin、GFAP、β．TubulinⅢ的表達(dá)率。誘導(dǎo)分化第10天測(cè)定細(xì)胞周期和倍體．誘導(dǎo)分化4小時(shí)和第10天做各相關(guān)特異性蛋白免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果BTSC在含血清條件下培養(yǎng)，和未用VPA組相比，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，GFAP、β．TubulinⅡ的表達(dá)率明顯升高，但是Nestin表達(dá)率沒有降低，且和CDl33一直存在，沒有呈現(xiàn)先降再

7、升的趨勢(shì)。細(xì)胞周期受到阻滯，G0/G1期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例減少，這種誘導(dǎo)作用沒有表現(xiàn)出明顯的藥物作用時(shí)間和作用濃度的依賴性。BTSC在無血清加生長(zhǎng)因子條件下培養(yǎng)，和未用VPA組相比，細(xì)胞形成克隆球的能力沒有下降，特異性蛋白的表達(dá)率沒有明顯差異(P＞0.05)，均以Nestin為主，GFAP、B．TubulinⅢ的表達(dá)率非常低，細(xì)胞周期和倍體測(cè)定結(jié)果差異也不顯著(P＞0.05)。結(jié)論BTSC在含血清條件下培養(yǎng)，VPA對(duì)貼壁生