山羊精原干細胞體外增殖及其分化的調控.pdf

1、精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性動物精子發(fā)生的基礎，并通過自我增殖和分化產生大量的精子，維持雄性動物終生生育能力。動物睪丸中SSCs數量極少，建立一個有效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，使SSCs在體外大量增殖，以獲得足量的SSCs，再對其進行轉基因調控后，移植到供體動物體內或體外分化的方式獲得通過減數分裂的精細胞或完整的精子，可為克隆動物、轉基因動物生產及一些人類遺傳性疾病的基因治療提供新的途徑。山羊是

2、一種經濟適用且孕期短家畜，能用于生產轉基因重組蛋白和多種有價值的產品。因此，研究山羊SSCs體外增殖和分化調控的影響因素可逐步建立山羊SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)，進而在生物醫(yī)學的研究、農產品和生物制藥業(yè)上更具有重要的意義。
　　為了逐步建立一個有效的山羊SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)，使SSCs在體外大量增殖，同時，為以后對山羊SSCs進行轉基因調控后，制作轉基因動物。本課題主要開展以下研究:(1)篩選合適日齡的山羊睪丸作為獲取山羊SSCs的材料

3、，以合適日齡的山羊為獲得SSCs供體，篩選合適分離睪丸組織為細胞懸液的消化方法，再篩選的合適日齡和適當消化方法的基礎上，進而篩選合適純化富集山羊SSCs的純化方法，建立山羊SSCs分離和純化方法。(2)建立三種細胞系，以這三種細胞作為飼養(yǎng)層，研究飼養(yǎng)層對山羊SSCs促增殖作用及其機制。(3)在培養(yǎng)液中添加不同濃度的抗氧化劑Vc后，研究Vc山羊SSCs促增殖作用及其機制。(4)研究不同移植部位和肝細胞生長因子(HGF)對移植后睪丸細胞重構

4、生精小管的能力及分化過程的影響。(5)探究在3D-SACS培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加不同促分化因子對山羊SSCs的促分化作用及調控。
　　以上研究獲得結果如下:
　　(1)隨著山羊發(fā)育的性成熟，睪丸生殖細胞分化成多層細胞;不同日齡山羊睪丸經過三步酶消化后，所得睪丸細胞總數以5月齡最高，1月齡最低;流式細胞鑒定1月山羊Thy-1+細胞數顯著高于3月齡、5月齡和大于2年的山羊(P＜0.05);培養(yǎng)10d后，來源于1月山羊的Thy-1+細胞

5、數最高(P＜0.05)，且克隆數和克隆區(qū)域最高。胰酶冷消化所得細胞數量顯著(P＜0.05)高于三步消化酶聯合消化和兩步酶消化，但細胞存活率顯著低于三步酶和兩步酶聯合消化(P＜0.05);純化后的細胞培養(yǎng)7d后，以三步酶消化克隆數顯著高于(P＜0.05)兩步酶和胰酶冷消化，而兩步酶克隆數顯著（P＜0.05）高于胰酶冷消化。經過五種方法進行純化后，抗體盤化法純化后所得的細胞總數和Thy-1+細胞均最少，顯著低于其他4組（P＜0.05）;BS

6、A+層粘連蛋白聯合純化所得到的Thy-1+細胞數最多，培養(yǎng)10 d后克隆數最多;五種方法純化后克隆面積沒有顯著性變化(P＞0.05)，克隆均表現為AKP陽性。
　　(2)在不同飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)后4、7、12d山羊SSCs克隆形態(tài)不會發(fā)生變化，表現為AKP染色陽性，均表達SSCs標記物β1-整合素、α6-整合素、Oct-4、PLZF和Vasa;克隆數以GEF飼養(yǎng)層上最多，克隆面積以GSC飼養(yǎng)層上最大，MEF飼養(yǎng)層上克隆數和面積均最小;

7、無論培養(yǎng)時間長短，SSCs促生長關鍵因子GDNF、bFGF和IGF1含量在GSC飼養(yǎng)層中含量最高，而LIF含量最低;而另兩種成纖維細胞飼養(yǎng)層幾種因子分泌量差別不大。
　　(3)培養(yǎng)10d后，山羊SSCs在不同濃度的Vc培養(yǎng)液中能夠形成致密的克隆，不同濃度的Vc不影響山羊SSCs克隆形態(tài)，而SSCs克隆數和區(qū)域均以添加40μg/mLVc最大;且流式細胞檢測在添加40μg/mL Vc組Thy-1+和Oct-4+細胞數最多;不同Vc組均

8、表達SSCs標記物和AKP活性。此外，在不同Vc組均隨著培養(yǎng)時間延長而ROS增多;但在同一培養(yǎng)時間內，40μg/mL Vc組的ROS含量均最低，且抗凋亡基因Bcl-2的表達增強，而抑制凋亡基因Bax和P53的表達減弱。
　　(4)三步酶消化后細胞懸液制成移植塊移植后20 d，移植到腎包膜下HGF處理和未處理與移植到背部皮下HGF處理和未處理四組之間移植塊重量差異均不顯著(P＞0.05);在移植后40、60 d，移植到腎包膜下HGF

9、處理后移植塊重量顯著高于背部皮下和腎包膜下HGF未處理組(P＜0.05)，其余各組差異不顯著(P＞0.05); RT-PCR和qRT-PCR檢測表明，減數分裂前基因PGP9.5、Thy1、Oct4和生殖細胞標記物VASA表達量未見明顯變化，但減數分裂細胞標記物STRA8、SCP3及減數分裂后細胞標記物Prm-1、Acrosin以HGF處理后移植到腎包膜下表達最強。
　　(5)三步酶消化后細胞懸液中含有支持細胞、生殖細胞、管周肌樣細

10、胞和間質細胞。在3D-SACS培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導分化培養(yǎng)30、50和70 d后，經過倍體分析發(fā)現均以試驗三組的分化效果最好;且培養(yǎng)克隆中單倍體生殖細胞標記物HSC70t的表達量均以試驗三組最高;通過RT-PCR和qRT-PCR檢測可知，在分化培養(yǎng)后的30、50和70 d，減數分裂前基因Thy-1和Oct4在各組中表達量均沒有顯著性差異(P＞0.05)。PGP9.5在培養(yǎng)后30 d，對照組PGP9.5表達量顯著高于試驗三組(P＜0.05)，其

11、他各組之間差異不顯著(P＞0.05);在培養(yǎng)后50和70 d，各組之間差異均不顯著(P＞0.05)。在分化培養(yǎng)后的30 d，對照組c-Kit表達量顯著低于試驗二組和三組(P＜0.05);在分化培養(yǎng)后的50、70 d，c-Kit表達仍以試驗三組表達最強，顯著高于對照組（P＜0.05），但其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。減數分裂期基因Scp3、Stra8在分化培養(yǎng)后30、50和70 d，對照組Scp3表達量顯著低于其他三組(P＜0.

12、05);減數分離后基因Acrosin和Prm-1在分化培養(yǎng)后30、50和70 d，在對照組減數分離后基因的表達顯著低于其他三組（P＜0.05）。
　　通過以上研究得到結論如下:
　　(1)以1月山羊適合為分離SSCs的供體動物，通過三步酶消化最充分，所得SSCs數量最多，再以BSA+層粘連蛋白聯合純化后，得到的SSCs數量最多，活性最強。
　　(2)山羊GSC和GEF更適合用于山羊SSCs的培養(yǎng)。
　　(3)在山