山羊精原干細(xì)胞體外增殖及其分化的調(diào)控.pdf

1、精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性動(dòng)物精子發(fā)生的基礎(chǔ)，并通過(guò)自我增殖和分化產(chǎn)生大量的精子，維持雄性動(dòng)物終生生育能力。動(dòng)物睪丸中SSCs數(shù)量極少，建立一個(gè)有效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，使SSCs在體外大量增殖，以獲得足量的SSCs，再對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因調(diào)控后，移植到供體動(dòng)物體內(nèi)或體外分化的方式獲得通過(guò)減數(shù)分裂的精細(xì)胞或完整的精子，可為克隆動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)及一些人類遺傳性疾病的基因治療提供新的途徑。山羊是

2、一種經(jīng)濟(jì)適用且孕期短家畜，能用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因重組蛋白和多種有價(jià)值的產(chǎn)品。因此，研究山羊SSCs體外增殖和分化調(diào)控的影響因素可逐步建立山羊SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)，進(jìn)而在生物醫(yī)學(xué)的研究、農(nóng)產(chǎn)品和生物制藥業(yè)上更具有重要的意義。
　　為了逐步建立一個(gè)有效的山羊SSCs體外培養(yǎng)系統(tǒng)，使SSCs在體外大量增殖，同時(shí)，為以后對(duì)山羊SSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)基因調(diào)控后，制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本課題主要開(kāi)展以下研究:(1)篩選合適日齡的山羊睪丸作為獲取山羊SSCs的材料

3、，以合適日齡的山羊?yàn)楂@得SSCs供體，篩選合適分離睪丸組織為細(xì)胞懸液的消化方法，再篩選的合適日齡和適當(dāng)消化方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)而篩選合適純化富集山羊SSCs的純化方法，建立山羊SSCs分離和純化方法。(2)建立三種細(xì)胞系，以這三種細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，研究飼養(yǎng)層對(duì)山羊SSCs促增殖作用及其機(jī)制。(3)在培養(yǎng)液中添加不同濃度的抗氧化劑Vc后，研究Vc山羊SSCs促增殖作用及其機(jī)制。(4)研究不同移植部位和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)移植后睪丸細(xì)胞重構(gòu)

4、生精小管的能力及分化過(guò)程的影響。(5)探究在3D-SACS培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加不同促分化因子對(duì)山羊SSCs的促分化作用及調(diào)控。
　　以上研究獲得結(jié)果如下:
　　(1)隨著山羊發(fā)育的性成熟，睪丸生殖細(xì)胞分化成多層細(xì)胞;不同日齡山羊睪丸經(jīng)過(guò)三步酶消化后，所得睪丸細(xì)胞總數(shù)以5月齡最高，1月齡最低;流式細(xì)胞鑒定1月山羊Thy-1+細(xì)胞數(shù)顯著高于3月齡、5月齡和大于2年的山羊(P＜0.05);培養(yǎng)10d后，來(lái)源于1月山羊的Thy-1+細(xì)胞

5、數(shù)最高(P＜0.05)，且克隆數(shù)和克隆區(qū)域最高。胰酶冷消化所得細(xì)胞數(shù)量顯著(P＜0.05)高于三步消化酶聯(lián)合消化和兩步酶消化，但細(xì)胞存活率顯著低于三步酶和兩步酶聯(lián)合消化(P＜0.05);純化后的細(xì)胞培養(yǎng)7d后，以三步酶消化克隆數(shù)顯著高于(P＜0.05)兩步酶和胰酶冷消化，而兩步酶克隆數(shù)顯著（P＜0.05）高于胰酶冷消化。經(jīng)過(guò)五種方法進(jìn)行純化后，抗體盤(pán)化法純化后所得的細(xì)胞總數(shù)和Thy-1+細(xì)胞均最少，顯著低于其他4組（P＜0.05）;BS

6、A+層粘連蛋白聯(lián)合純化所得到的Thy-1+細(xì)胞數(shù)最多，培養(yǎng)10 d后克隆數(shù)最多;五種方法純化后克隆面積沒(méi)有顯著性變化(P＞0.05)，克隆均表現(xiàn)為AKP陽(yáng)性。
　　(2)在不同飼養(yǎng)層上，培養(yǎng)后4、7、12d山羊SSCs克隆形態(tài)不會(huì)發(fā)生變化，表現(xiàn)為AKP染色陽(yáng)性，均表達(dá)SSCs標(biāo)記物β1-整合素、α6-整合素、Oct-4、PLZF和Vasa;克隆數(shù)以GEF飼養(yǎng)層上最多，克隆面積以GSC飼養(yǎng)層上最大，MEF飼養(yǎng)層上克隆數(shù)和面積均最小;

7、無(wú)論培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短，SSCs促生長(zhǎng)關(guān)鍵因子GDNF、bFGF和IGF1含量在GSC飼養(yǎng)層中含量最高，而LIF含量最低;而另兩種成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層幾種因子分泌量差別不大。
　　(3)培養(yǎng)10d后，山羊SSCs在不同濃度的Vc培養(yǎng)液中能夠形成致密的克隆，不同濃度的Vc不影響山羊SSCs克隆形態(tài)，而SSCs克隆數(shù)和區(qū)域均以添加40μg/mLVc最大;且流式細(xì)胞檢測(cè)在添加40μg/mL Vc組Thy-1+和Oct-4+細(xì)胞數(shù)最多;不同Vc組均

8、表達(dá)SSCs標(biāo)記物和AKP活性。此外，在不同Vc組均隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而ROS增多;但在同一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，40μg/mL Vc組的ROS含量均最低，且抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)，而抑制凋亡基因Bax和P53的表達(dá)減弱。
　　(4)三步酶消化后細(xì)胞懸液制成移植塊移植后20 d，移植到腎包膜下HGF處理和未處理與移植到背部皮下HGF處理和未處理四組之間移植塊重量差異均不顯著(P＞0.05);在移植后40、60 d，移植到腎包膜下HGF

9、處理后移植塊重量顯著高于背部皮下和腎包膜下HGF未處理組(P＜0.05)，其余各組差異不顯著(P＞0.05); RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)表明，減數(shù)分裂前基因PGP9.5、Thy1、Oct4和生殖細(xì)胞標(biāo)記物VASA表達(dá)量未見(jiàn)明顯變化，但減數(shù)分裂細(xì)胞標(biāo)記物STRA8、SCP3及減數(shù)分裂后細(xì)胞標(biāo)記物Prm-1、Acrosin以HGF處理后移植到腎包膜下表達(dá)最強(qiáng)。
　　(5)三步酶消化后細(xì)胞懸液中含有支持細(xì)胞、生殖細(xì)胞、管周肌樣細(xì)

10、胞和間質(zhì)細(xì)胞。在3D-SACS培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)30、50和70 d后，經(jīng)過(guò)倍體分析發(fā)現(xiàn)均以試驗(yàn)三組的分化效果最好;且培養(yǎng)克隆中單倍體生殖細(xì)胞標(biāo)記物HSC70t的表達(dá)量均以試驗(yàn)三組最高;通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)可知，在分化培養(yǎng)后的30、50和70 d，減數(shù)分裂前基因Thy-1和Oct4在各組中表達(dá)量均沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。PGP9.5在培養(yǎng)后30 d，對(duì)照組PGP9.5表達(dá)量顯著高于試驗(yàn)三組(P＜0.05)，其

11、他各組之間差異不顯著(P＞0.05);在培養(yǎng)后50和70 d，各組之間差異均不顯著(P＞0.05)。在分化培養(yǎng)后的30 d，對(duì)照組c-Kit表達(dá)量顯著低于試驗(yàn)二組和三組(P＜0.05);在分化培養(yǎng)后的50、70 d，c-Kit表達(dá)仍以試驗(yàn)三組表達(dá)最強(qiáng)，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），但其他各組之間差異不顯著(P＞0.05)。減數(shù)分裂期基因Scp3、Stra8在分化培養(yǎng)后30、50和70 d，對(duì)照組Scp3表達(dá)量顯著低于其他三組(P＜0.

12、05);減數(shù)分離后基因Acrosin和Prm-1在分化培養(yǎng)后30、50和70 d，在對(duì)照組減數(shù)分離后基因的表達(dá)顯著低于其他三組（P＜0.05）。
　　通過(guò)以上研究得到結(jié)論如下:
　　(1)以1月山羊適合為分離SSCs的供體動(dòng)物，通過(guò)三步酶消化最充分，所得SSCs數(shù)量最多，再以BSA+層粘連蛋白聯(lián)合純化后，得到的SSCs數(shù)量最多，活性最強(qiáng)。
　　(2)山羊GSC和GEF更適合用于山羊SSCs的培養(yǎng)。
　　(3)在山