影響山羊精原干細(xì)胞分離純化和體外培養(yǎng)的因素研究.pdf

1、精原干細(xì)胞（Spermatogonial stem cells，SSCs）是雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞中唯一的干細(xì)胞，在體外長期培養(yǎng)一直是國際性的難題和研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)建立了小鼠、大鼠和倉鼠三個(gè)物種的精原干細(xì)胞體外長期培養(yǎng)體系，但在其它物種、特別是家畜尚未獲得理想的培養(yǎng)體系。本課題通過檢測(cè)分離山羊SSCs的純度來確定最適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡;利用絲裂霉素-C和胰蛋白酶先后共同處理三種細(xì)胞(MEF、STO、Hela)后，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的穩(wěn)定性來篩選

2、出最佳的飼養(yǎng)層制備條件;分別采用不同濃度的血清及三種外源添加物（即枸杞多糖、維生素C、細(xì)胞分裂素）體外培養(yǎng)SSCs，檢測(cè)SSCs克隆數(shù)量及其增殖能力，最終確定山羊SSCs體外培養(yǎng)的最佳方案。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.山羊年齡對(duì)SSCs分離純化效果的影響分別取2-5月齡的波爾山羊睪丸，以CDH1、UCHL1和THY1作為鑒定山羊SSCs的表面表型標(biāo)記，通過檢測(cè)不同月齡山羊睪丸中不同分子標(biāo)記的定位、mRNA和蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯

3、示在2、5月齡睪丸中均有CDH1和UCHL1的定位表達(dá);CDH1mRNA和蛋白表達(dá)量隨著月齡增加而下降，其中2月齡表達(dá)量最高;而THY1和UCHL1的表達(dá)量先上升后下降，在3月齡達(dá)到最高值。此結(jié)果表明2-3月齡是分離純化山羊SSCs的最優(yōu)年齡。
　　2.絲裂霉素-C處理時(shí)間和胰蛋白酶對(duì)飼養(yǎng)層制備效果的影響取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、鼠胚成纖維細(xì)胞系(STO)和子宮頸癌細(xì)胞(Hela)三種細(xì)胞作為飼養(yǎng)層。其中MEF分成6大組，分

4、別用10μg/mL絲裂霉素-C處理不同時(shí)間(0h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h)后，各組再分成2小組，其中一組用0.25％胰蛋白酶消化作為處理組，另一組不做處理作為非處理組，并在不同培養(yǎng)時(shí)間下檢測(cè)增殖能力，以增殖能力穩(wěn)定性和組間差異顯著性作為評(píng)定依據(jù)。STO和Hela處理方法同MEF。結(jié)果顯示，非處理組增殖能力穩(wěn)定，而處理組增殖能力不穩(wěn)定，這表明處理組不利于制備飼養(yǎng)層細(xì)胞;在非處理組中，絲裂霉素-C處理MEF細(xì)胞1.5h、S

5、TO細(xì)胞2.5h、Hela細(xì)胞2.5h時(shí)，細(xì)胞增殖能力比較穩(wěn)定，并與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05)。此結(jié)果表明不經(jīng)過胰蛋白酶消化處理的方法最好，并且10μg/mL絲裂霉素-C處理MEF細(xì)胞1.5h，STO細(xì)胞2.5h，Hela細(xì)胞2.5h是最優(yōu)選擇。
　　3.血清濃度對(duì)山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度血清(0％、1％、2.5％、5％)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs，以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評(píng)定依據(jù)。結(jié)果顯示，在培

6、養(yǎng)第3d時(shí)，5％血清組克隆數(shù)顯著高于其它組(P＜0.05)，但克隆數(shù)隨著時(shí)間的增加而大幅度減少，增殖能力明顯下降;在第6d和第10d時(shí)，2.5％血清組顯著促進(jìn)SSCs的增殖，并且克隆數(shù)顯著高于其它組(P＜0.05)，增殖速度最快。此結(jié)果表明5％血清濃度不利于SSCs體外長期培養(yǎng)，而2.5％血清濃度是體外培養(yǎng)體系的最優(yōu)選擇。
　　4.枸杞多糖濃度對(duì)山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度枸杞多糖（LBP）（0μg/mL、50μg

7、/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL）的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs，以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評(píng)定依據(jù)。結(jié)果顯示，200μg/mL和300μg/mL LBP組克隆數(shù)一直顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，并且100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL LBP組克隆數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而減少;在培養(yǎng)第6d和第10d時(shí)，50μg/mL LBP組SSCs克隆數(shù)最多，增殖速度最快。此結(jié)果表明高濃度LBP抑制S

8、SCs增殖，添加50μg/mL LBP是SSCs體外培養(yǎng)的最優(yōu)選擇。
　　5.維生素C濃度對(duì)山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度維生素C(VC)(0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs，以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評(píng)定依據(jù)。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的增加，各組克隆數(shù)均是先上升后下降;在第6d和第10d時(shí)，克隆數(shù)隨著濃度的升高而增加，且各組之間差異顯著(P＜0

9、.05)，但40μg/mL VC組在第7-10d的增殖能力顯著低于其它組(P＜0.05);在培養(yǎng)第8-10d時(shí)，30μg/mL VC組增殖能力基本保持不變，但其它組均下降，并且30μg/mL VC組克隆數(shù)顯著高于其它低濃度組（P＜0.05）。此結(jié)果表明40μg/mL VC不利于SSCs體外長期培養(yǎng)，添加30μg/mLVC是SSCs體外培養(yǎng)的最優(yōu)選擇。
　　6.細(xì)胞分裂素濃度對(duì)山羊SSCs體外培養(yǎng)效果的影響在添加不同濃度細(xì)胞分裂素（

10、6-BA）(0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、75ng/mL、100ng/mL、125ng/mL)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)山羊SSCs，以SSCs克隆數(shù)及其增殖能力作為評(píng)定依據(jù)。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)第6d和第10d時(shí)，100ng/mL6-BA組克隆數(shù)顯著高于其它組(P＜0.05)，但所有試驗(yàn)組增殖能力均低于對(duì)照組，這表明6-BA不適于SSCs長期體外培養(yǎng)。此結(jié)果表明添加100ng/mL6-BA是SSCs短期體外培養(yǎng)的最優(yōu)選擇。