小鼠精原干細胞分離、純化、冷凍、培養(yǎng)、移植及其體內介導轉基因的研究.pdf

1、精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)指既能自我更新維持自身群體數(shù)量恒定，又能定向分化成生殖細胞進而產(chǎn)生精子的一類原始精原細胞，具有干細胞最根本的生物學性質。目前，SSCs的研究在動物精子發(fā)生發(fā)育機理、醫(yī)學臨床的男性生殖生理和轉基因動物的制備等方面具有廣闊的應用前景，已成為干細胞研究的熱點之 一。本試驗以小鼠精原干細胞為材料，對其冷凍保存、培養(yǎng)以及體內介導的轉基因技術進行初步研究，以期為SSC

2、s的進一步研究和利用提供參考資料，本試驗的具體內容如下： 1.用組合酶消化法制備6日齡小鼠的生殖細胞懸液；采用差速貼壁法結合Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離純化精原干細胞，接種于含10％胎牛血清的極限必需培養(yǎng)基a(minimum essential medium alpha，MEMa)中，37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)細胞的生長和形態(tài)變化。結果6日齡小鼠的生精小管主要包含細胞為精原干細胞、支持細胞，精原干細胞純化

3、后純度達80％以上，精原干細胞主要分布在28％～36％的Percoll梯度中。 2.以6日齡雄性昆明小白鼠精原干細胞為材料，加入不同的冷凍液以及采用不同的降溫速率冷凍小鼠精原干細胞。以MEMa為基本培養(yǎng)基，加入10％胎牛血清和100ng/mL的膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，體外培養(yǎng)復蘇后精原干細胞，WST-8比色法分析培養(yǎng)精原干細胞的增殖率，運用堿性磷酸酶細胞化學染色和逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription

4、 polymerase chain reaction，RT-PCR)技術，對培養(yǎng)的精原干細胞進行鑒定，采用睪丸網(wǎng)注射法將非程控降溫方式冷凍的小鼠精原干細胞移植到受體不育小鼠睪丸生精小管，檢測精原干細胞特性。結果顯示，冷凍液中添加10％二甲基亞砜、10％胎牛血清、0.07mol/L蔗糖時，以1℃/min程控降溫方式冷凍小鼠SSCs，細胞解凍后活率最高，達84％以上；采用非程控降溫方式凍存精原干細胞，盡管細胞解凍后活率相對于程控降溫方式略低

5、，但具有方法簡單、易于操作、無需昂貴儀器的優(yōu)點，復蘇后精原干細胞貼壁時間為8h～12h，24h可見細胞分裂，48h細胞出現(xiàn)迅速增殖，96 h可見較多含20～25細胞的細胞團，此時，精原干細胞增殖近5倍；精原干細胞移植后，在受體小鼠睪丸生精小管重新啟動精子發(fā)生。試驗結果表明，本試驗所用的冷凍條件可以使經(jīng)長期冷凍的精原干細胞保留其特性；所用培養(yǎng)條件可以使經(jīng)長期冷凍的精原干細胞短期快速增殖。 3.應用顯微注射儀將脂質體包裹的質粒pEG