牛精原干細(xì)胞分離純化及長(zhǎng)期培養(yǎng)研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性哺乳動(dòng)物個(gè)體中唯一能夠?qū)⑦z傳信息以自然交配的方式傳遞給子代的成體干細(xì)胞。精原干細(xì)胞通過自我更新性增殖和分化來維持整個(gè)睪丸中完整生精過程的平衡和進(jìn)行。最早關(guān)于SSCs的研究始于小鼠，并且到目前為止已成功建立了小鼠SSCs分離純化、體外長(zhǎng)期培養(yǎng)、精原干細(xì)胞移植和基因修飾等一系列技術(shù)方法。這些技術(shù)的建立不僅為小鼠生精過程的研究奠定了強(qiáng)有力的基礎(chǔ)，而且為其他哺乳動(dòng)物

2、生精過程的研究提供了借鑒。雖然家畜動(dòng)物SSCs研究進(jìn)展相對(duì)緩慢，但隨著近些年對(duì)大動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究逐步深入，在其分離純化及長(zhǎng)期培養(yǎng)方面已取得了一些重要進(jìn)展。本研究借鑒已報(bào)道的哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究成果，利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的大鼠、綿羊、山羊和豬精原干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法，對(duì)本地的黑白花奶牛精原干細(xì)胞進(jìn)行了分離純化、體外長(zhǎng)期培養(yǎng)、標(biāo)記分子鑒定、體外誘導(dǎo)分化和移植等一系列研究，已經(jīng)取得了一些可喜的結(jié)果。
　　1.黑白花奶牛精原干細(xì)

3、胞的分離和純化
　　本研究以6-8月齡黑白花奶牛為研究對(duì)象，通過三步酶消化方法將黑白花奶牛的睪丸組織進(jìn)行消化，并得到了大約3×107細(xì)胞(n=5，±0.5×107)。獲得的單細(xì)胞懸液進(jìn)一步利用明膠、膠原蛋白和層粘連蛋白Laminin等基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿進(jìn)行差異貼壁，以達(dá)到分離純化牛精原干細(xì)胞(bovine spermatogonial stemcells，bSSCs)的目的。為確定純化過程中每個(gè)步驟對(duì)牛精原干細(xì)胞的富集率，本實(shí)驗(yàn)采取

4、對(duì)各步驟得到的細(xì)胞進(jìn)行涂片，并利用免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)了純化細(xì)胞中的PLZF陽(yáng)性細(xì)胞比率。通過對(duì)睪丸單細(xì)胞懸液(Single cell suspension，SCS)，不結(jié)合膠原蛋白Ⅰ細(xì)胞(CollagenⅠ non-binding cells，CNB)和Laminin結(jié)合細(xì)胞（Laminin binding cells，LB）進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過三次差異貼壁后bSSCs所占百分比率分別為24％±5％，50％±3％和83％±7％(n=5)

5、。本實(shí)驗(yàn)所的得到的bSSCs在純度上滿足了體外培養(yǎng)的要求，為bSSCs的體外培養(yǎng)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　2.黑白花奶牛精原干細(xì)胞的體外長(zhǎng)期培養(yǎng)與保存
　　通過對(duì)嚙齒類精原干細(xì)胞長(zhǎng)期體外培養(yǎng)方法的總結(jié)和改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)室建立了大動(dòng)物精原干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的體系。利用飼養(yǎng)層細(xì)胞和本實(shí)驗(yàn)室建立的家畜精原干細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)牛精原干細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，此培養(yǎng)體系能夠維持牛精原干細(xì)胞體外傳代31次以上，并保持其形態(tài)及標(biāo)記分子表達(dá)不變。

6、通過對(duì)連續(xù)3次傳代的牛SSCs進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在此培養(yǎng)體系中牛精原干細(xì)胞的增殖翻倍周期為5-7天左右。為確定此培養(yǎng)體系中的最佳GDNF濃度，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)體外培養(yǎng)的牛SSCs進(jìn)行添加不同濃度的GDNF(20 ng/ml、30 ng/ml、40ng/ml)，并體外連續(xù)培養(yǎng)7天后對(duì)牛精原干細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。發(fā)現(xiàn)隨著GDNF濃度的增加，精原干細(xì)胞的數(shù)目同樣增加。當(dāng)GDNF濃度為30 ng/ml以上時(shí)，相對(duì)于20 ng/ml組，對(duì)精原干細(xì)胞數(shù)目具有

7、顯著的提升作用(P＜0.01)。但30 ng/ml與40 ng/ml濃度GDNF處理組之間并無顯著性差異(P＞0.05)。通過對(duì)成本及傳代等因素的綜合考慮，在本實(shí)驗(yàn)體系巾添加30 ng/ml的GDNF為最佳體外培養(yǎng)牛精原干細(xì)胞濃度。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用含飼養(yǎng)層的無血清培養(yǎng)體系，通過添加GDNF、bFGF和Gfrα1等生長(zhǎng)因子，實(shí)現(xiàn)了bSSCs體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，并保持其標(biāo)記分子表達(dá)和生物學(xué)特性不變。長(zhǎng)期培養(yǎng)方法的建立為bSSCs的深入研究提供

8、了基礎(chǔ)。
　　3.體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的黑白花奶牛精原干細(xì)胞的標(biāo)記分子鑒定
　　為確定牛精原干細(xì)胞的標(biāo)記分子特性，本實(shí)驗(yàn)首先利用牛睪丸冰凍切片免疫熒光染色技術(shù)，對(duì)嚙齒類精原干細(xì)胞標(biāo)記分子CDH1進(jìn)行驗(yàn)證研究。以已報(bào)道的牛精原干細(xì)胞標(biāo)記分子PLZF標(biāo)記牛精原干細(xì)胞，然后進(jìn)行CDH1免疫熒光染色。結(jié)果顯示CDH1在牛睪丸中與PLZF在靠近基底膜的單個(gè)型、成對(duì)型和成串型的精原細(xì)胞中重疊分布，說明CDHI也是bSSCs的一個(gè)標(biāo)記分子。進(jìn)一步

9、對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)的牛精原干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)牛精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)標(biāo)記基因Thy1和CDH1。為了鑒定體外長(zhǎng)期培養(yǎng)牛精原干細(xì)胞特性，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用已報(bào)道的哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞標(biāo)記分子進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光雙標(biāo)染色分析，發(fā)現(xiàn)在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的牛精原干細(xì)胞中PGP9.5，Gfrα1，Oct4，Thy1及CDH1等的分布與PLZF完全重合。這些結(jié)果說明上述基因在bSSCs中保守表達(dá)，并且證實(shí)了本研究中長(zhǎng)期培養(yǎng)的bSSCs維持精原干細(xì)胞標(biāo)記分子

10、的表達(dá)特性。這些結(jié)果也為bSSCs的進(jìn)一步研究提供了質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。
　　4.黑白花奶牛精原干細(xì)胞的功能鑒定
　　為驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)中體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的bSSCs是否保持分化形成下級(jí)生精細(xì)胞的能力，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用體外誘導(dǎo)分化和受體犏牛睪丸移植技術(shù)對(duì)bSSCs的分化能力進(jìn)行了驗(yàn)證。通過借鑒Dym等體外誘導(dǎo)bSSCs的報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室已建立的綿羊SSCs體外誘導(dǎo)的方法，利用含血清的培養(yǎng)液中添加SCF因子對(duì)體外培養(yǎng)的bSSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，十天后

11、利用免疫熒光染色方法在分化體系中檢測(cè)到SCP3陽(yáng)性精母細(xì)胞的存在，說明bSSCs在體外培養(yǎng)條件下具有分化的生理活性。進(jìn)一步通過bSSCs體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)，利用天然不育的公犏牛作為受體，將體外培養(yǎng)至15代并冷凍保存的bSSCs移植到犏牛的睪丸內(nèi)。移植一年后，通過組織切片、Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)，受體犏牛睪丸內(nèi)高表達(dá)SSCs、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞的標(biāo)記基因PGP9.5，SCP3和Tnp2，說明黑白花牛的bSSCs能夠在犏牛睪丸中長(zhǎng)期存