牛精原干細胞分離純化及長期培養(yǎng)研究.pdf

1、精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性哺乳動物個體中唯一能夠?qū)⑦z傳信息以自然交配的方式傳遞給子代的成體干細胞。精原干細胞通過自我更新性增殖和分化來維持整個睪丸中完整生精過程的平衡和進行。最早關(guān)于SSCs的研究始于小鼠，并且到目前為止已成功建立了小鼠SSCs分離純化、體外長期培養(yǎng)、精原干細胞移植和基因修飾等一系列技術(shù)方法。這些技術(shù)的建立不僅為小鼠生精過程的研究奠定了強有力的基礎(chǔ)，而且為其他哺乳動物

2、生精過程的研究提供了借鑒。雖然家畜動物SSCs研究進展相對緩慢，但隨著近些年對大動物精原干細胞的研究逐步深入，在其分離純化及長期培養(yǎng)方面已取得了一些重要進展。本研究借鑒已報道的哺乳動物精原干細胞的研究成果，利用本實驗室已建立的大鼠、綿羊、山羊和豬精原干細胞體外長期培養(yǎng)的方法，對本地的黑白花奶牛精原干細胞進行了分離純化、體外長期培養(yǎng)、標記分子鑒定、體外誘導分化和移植等一系列研究，已經(jīng)取得了一些可喜的結(jié)果。
　　1.黑白花奶牛精原干細

3、胞的分離和純化
　　本研究以6-8月齡黑白花奶牛為研究對象，通過三步酶消化方法將黑白花奶牛的睪丸組織進行消化，并得到了大約3×107細胞(n=5，±0.5×107)。獲得的單細胞懸液進一步利用明膠、膠原蛋白和層粘連蛋白Laminin等基質(zhì)包被的培養(yǎng)皿進行差異貼壁，以達到分離純化牛精原干細胞(bovine spermatogonial stemcells，bSSCs)的目的。為確定純化過程中每個步驟對牛精原干細胞的富集率，本實驗采取

4、對各步驟得到的細胞進行涂片，并利用免疫熒光染色技術(shù)檢測了純化細胞中的PLZF陽性細胞比率。通過對睪丸單細胞懸液(Single cell suspension，SCS)，不結(jié)合膠原蛋白Ⅰ細胞(CollagenⅠ non-binding cells，CNB)和Laminin結(jié)合細胞（Laminin binding cells，LB）進行檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過三次差異貼壁后bSSCs所占百分比率分別為24％±5％，50％±3％和83％±7％(n=5)

5、。本實驗所的得到的bSSCs在純度上滿足了體外培養(yǎng)的要求，為bSSCs的體外培養(yǎng)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　2.黑白花奶牛精原干細胞的體外長期培養(yǎng)與保存
　　通過對嚙齒類精原干細胞長期體外培養(yǎng)方法的總結(jié)和改進，本實驗室建立了大動物精原干細胞體外長期培養(yǎng)的體系。利用飼養(yǎng)層細胞和本實驗室建立的家畜精原干細胞培養(yǎng)液對牛精原干細胞進行長期體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，此培養(yǎng)體系能夠維持牛精原干細胞體外傳代31次以上，并保持其形態(tài)及標記分子表達不變。

6、通過對連續(xù)3次傳代的牛SSCs進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在此培養(yǎng)體系中牛精原干細胞的增殖翻倍周期為5-7天左右。為確定此培養(yǎng)體系中的最佳GDNF濃度，本實驗通過對體外培養(yǎng)的牛SSCs進行添加不同濃度的GDNF(20 ng/ml、30 ng/ml、40ng/ml)，并體外連續(xù)培養(yǎng)7天后對牛精原干細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。發(fā)現(xiàn)隨著GDNF濃度的增加，精原干細胞的數(shù)目同樣增加。當GDNF濃度為30 ng/ml以上時，相對于20 ng/ml組，對精原干細胞數(shù)目具有

7、顯著的提升作用(P＜0.01)。但30 ng/ml與40 ng/ml濃度GDNF處理組之間并無顯著性差異(P＞0.05)。通過對成本及傳代等因素的綜合考慮，在本實驗體系巾添加30 ng/ml的GDNF為最佳體外培養(yǎng)牛精原干細胞濃度。綜上所述，本實驗采用含飼養(yǎng)層的無血清培養(yǎng)體系，通過添加GDNF、bFGF和Gfrα1等生長因子，實現(xiàn)了bSSCs體外長期培養(yǎng)，并保持其標記分子表達和生物學特性不變。長期培養(yǎng)方法的建立為bSSCs的深入研究提供

8、了基礎(chǔ)。
　　3.體外長期培養(yǎng)的黑白花奶牛精原干細胞的標記分子鑒定
　　為確定牛精原干細胞的標記分子特性，本實驗首先利用牛睪丸冰凍切片免疫熒光染色技術(shù)，對嚙齒類精原干細胞標記分子CDH1進行驗證研究。以已報道的牛精原干細胞標記分子PLZF標記牛精原干細胞，然后進行CDH1免疫熒光染色。結(jié)果顯示CDH1在牛睪丸中與PLZF在靠近基底膜的單個型、成對型和成串型的精原細胞中重疊分布，說明CDHI也是bSSCs的一個標記分子。進一步

9、對長期培養(yǎng)的牛精原干細胞的基因轉(zhuǎn)錄進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)牛精原干細胞轉(zhuǎn)錄表達標記基因Thy1和CDH1。為了鑒定體外長期培養(yǎng)牛精原干細胞特性，本實驗應用已報道的哺乳動物精原干細胞標記分子進行細胞免疫熒光雙標染色分析，發(fā)現(xiàn)在體外長期培養(yǎng)的牛精原干細胞中PGP9.5，Gfrα1，Oct4，Thy1及CDH1等的分布與PLZF完全重合。這些結(jié)果說明上述基因在bSSCs中保守表達，并且證實了本研究中長期培養(yǎng)的bSSCs維持精原干細胞標記分子

10、的表達特性。這些結(jié)果也為bSSCs的進一步研究提供了質(zhì)量檢測標準。
　　4.黑白花奶牛精原干細胞的功能鑒定
　　為驗證本實驗中體外長期培養(yǎng)的bSSCs是否保持分化形成下級生精細胞的能力，本實驗進一步采用體外誘導分化和受體犏牛睪丸移植技術(shù)對bSSCs的分化能力進行了驗證。通過借鑒Dym等體外誘導bSSCs的報道及本實驗室已建立的綿羊SSCs體外誘導的方法，利用含血清的培養(yǎng)液中添加SCF因子對體外培養(yǎng)的bSSCs進行誘導，十天后

11、利用免疫熒光染色方法在分化體系中檢測到SCP3陽性精母細胞的存在，說明bSSCs在體外培養(yǎng)條件下具有分化的生理活性。進一步通過bSSCs體內(nèi)移植實驗，利用天然不育的公犏牛作為受體，將體外培養(yǎng)至15代并冷凍保存的bSSCs移植到犏牛的睪丸內(nèi)。移植一年后，通過組織切片、Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)，受體犏牛睪丸內(nèi)高表達SSCs、精母細胞和精子細胞的標記基因PGP9.5，SCP3和Tnp2，說明黑白花牛的bSSCs能夠在犏牛睪丸中長期存