雞精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是指位于曲精細(xì)管基膜上既能自我更新又能定向分化產(chǎn)生精母細(xì)胞直至精子的一類原始精原細(xì)胞，而支持細(xì)胞(sertolicells，SCs)作為生精上皮中的唯一體細(xì)胞，對SSCs起著重要的支持和營養(yǎng)作用。有關(guān)禽類SSCs的研究還很不成熟，而禽類睪丸SCs的分離培養(yǎng)至今未見正式報道。本研究以出雛20~30天的公雞睪丸和孵化18天的雞胚睪丸為實(shí)驗(yàn)材料，采用兩步酶消化法分離獲得

2、睪丸細(xì)胞懸液，對SSCs采用不同溫度、不同密度和不同飼養(yǎng)層的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)，以期建立適宜雞SSCs體外長期存活的培養(yǎng)體系，同時對培養(yǎng)的SSCs生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，并利用培養(yǎng)的SSCs進(jìn)行了體內(nèi)移植分化實(shí)驗(yàn)，而對于SCs則進(jìn)行了分離純化、原代和傳代的培養(yǎng)與鑒定。研究結(jié)果總結(jié)如下： 1.兩步酶消化法分離獲得的睪丸細(xì)胞活率達(dá)95％以上，是睪丸組織適宜的消化方法。 2.37℃C和38.5℃下，雞SSCs都能很好地生長，并能形

3、成增殖，兩者的培養(yǎng)結(jié)果差異不顯著(P>0.05)，但38.5℃下除雞SSCs生長更迅速外，SCs等其他細(xì)胞生長也更迅速，反而會抑制雞SSCs的生長，因此37℃更適宜作為雞SSCs的培養(yǎng)溫度。 3.5×105cell/mL，接種密度的培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于1×105cell/mL的培養(yǎng)效果(P<0.05)，而與1×106cell/mL的培養(yǎng)結(jié)果之間差異不顯著(P>0.05)，但5×105cell/mL的增殖率高于1×106cell/mL

4、的增殖率，更適宜作為雞SSCs體外培養(yǎng)的接種密度。 4.CEF和SCs兩種飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果之間差異不顯著(P>0.05)，但SCs飼養(yǎng)層培養(yǎng)24h的細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)96h的細(xì)胞數(shù)和增殖率均略高于CEF飼養(yǎng)層培養(yǎng)的結(jié)果，因此SCs更適合作為雞SSCs體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞。5。經(jīng)AKP染色法、PAS染色法和免疫化學(xué)染色鑒定，體外培養(yǎng)的雞SSCs仍保持著未分化的特性，說明我們的培養(yǎng)體系適合作為雞SSCs體外培養(yǎng)方法，且這幾種鑒定方法簡