雞精原干細胞介導轉基因的研究.pdf

1、精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是雄性生殖細胞的前體細胞，具有終生擴增性和永生性，是生殖系中唯一的在成體中還能增殖的細胞。目前，SSCs的研究對動物精子發(fā)生發(fā)育機理、醫(yī)學臨床的男性生殖生理和轉基因動物的制備方面具有廣闊的應用前景，己成為干細胞研究的熱點之一，本研究進行了體內、外雞SSCs轉染外源基因(pEGFP-N<,1>)建立轉基因雞的探索，對轉染后外源基因在當代、F<,1>、F<,2>代精子

2、、種蛋胚盤及不同孵化日齡胚胎及其組織器官中的整合、表達情況進行了檢測。研究結果如下幾個方面： 1．對公雞睪丸內注射pEGFP-N<,1>，觀察體內精原干細胞轉染外源基因整合以及在后代中表達情況。實驗雞在注射pEGFP-N<,1>一個生精周期(25d左右)后，定期檢測(轉染后25～240d內，每隔l周檢測1次)公雞精子轉染表達情況及southern blot檢測，結果發(fā)現(xiàn)：實驗雞在轉染70d后精子熒光表達率最高為19.1％，并維持

3、到180d后轉染率明顯下降至15％左右，此后一直保持這一轉染水平：對轉染后48h 0世代實驗公雞睪丸細胞、原始生殖細胞和10d胚齡成纖維細胞，檢測其熒光轉染率，結果顯示：轉染48h的公雞睪丸細胞表達有綠色熒光蛋白；孵化5.5d雞胚的原始生殖細胞和孵化10d的雞胚成纖維細胞綠色熒光表達率各為50.00％和66.67％；對0世代實驗雞睪丸組織以及后代中不同組織(胚盤、胚胎、心臟、腎臟、肝臟以及肌肉)，進行冰凍切片檢測和southern bl

4、ot檢測。結果顯示：0世代實驗雞睪丸組織，可清晰看到曲細精管中轉染細胞繞管分布呈環(huán)狀。F<,1>、F<,2>代雞胚胎不同組織間熒光蛋白表達強弱差異，在肝臟、腎臟表達強度高，其余組織熒光表達強度弱：未經(jīng)孵化的F<,1>、F<,2>代新生胚盤中陽性率各為71.69％和67.29％，F(xiàn)<,1>代胚盤的PCR陽性率為69.64％，孵化的胚胎PCR陽性率為60.08％，F(xiàn)<,2>代胚盤、胚胎的PCR陽性率各為61.33％和57.35％，經(jīng)sout

5、hem雜交檢測，證實外源基因(EGFP)已整合到精子基因組，且能通過體外受精在后代中穩(wěn)定表達。因此，睪丸內注射法可能是一種可行、簡單并利于推廣的制備轉基因雞的方法。 2．對接受精原干細胞移植的實驗受體雞，預先進行白消安處理，消除其內源性精原干細胞，結果顯示：白消安處理20d后，完全消除了內源性精原干細胞，可用于外源精原干細胞移植。電穿孔法轉染供體精原干細胞，轉染后培養(yǎng)2d時檢測轉染率為19.70％，培養(yǎng)10d時，轉染率為4.72％：篩選

6、轉染后表達熒光蛋白的精原干細胞移植入實驗受體雞睪丸內，一個生精周期(25d左右)后，采集不同時間階段實驗雞精液，進行常規(guī)檢測，結果顯示：移植25d后，采集精液發(fā)現(xiàn)，精液呈清水狀，精子密度和熒光表達率分別為1.57(10<'4>個/ml)和4.68％，移植75d時，精液為淡白色，精子密度和熒光表達率分別為1.35(10<'5>個/ml)和8.02％；精子DNA的PCR．檢測結果為陽性。對移植75d實驗雞睪丸組織制作冰凍切片，觀察到攜帶外源