RNAi介導的抗RSV轉基因水稻研究.pdf

1、水稻條紋葉枯病是熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的病毒病之一.在我國的粳稻產區(qū)一般會造成20～30﹪的減產.近年來，由于氣候和耕作的變化以及水稻品種的抗病性較差,我國江蘇、山東、河南等地種植的水稻遭受嚴重的經(jīng)濟損失.水稻條紋葉枯病由水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)引起,RSV是是纖細病毒屬 (Tenuivirus) 的代表種,主要由灰飛虱 (Laodelphax striatellusFallen)及其它3種飛虱持久性傳

2、播.RSV在電鏡下觀察呈絲狀粒體,以折疊、分枝和超螺旋等形式存在.RSV在寄主植物和介體昆蟲體內都能進行復制.RNAi是一種重要基因沉默現(xiàn)象,當表達來源于病毒某一基因或核苷酸序列的轉基因植物發(fā)生RNA沉默時,能對入侵的同一病毒或同屬中相近病毒的RNA進行降解,使入侵的病毒不能在植物中積累,從而賦予轉基因植物病毒抗性.本文對我國北方34個RSV分離物CP基因進行了實驗室分析,結果表明：CP基囚的核苷酸序列一致性在96.8～100﹪之間,說

3、明我國北方粳稻產區(qū)所發(fā)生的RSV CP基因非常保守,有利于siRNA的識別.因此,本文探索利用RNAi原理構建RSV CP基囚全長片段或部分片段介導的干涉載體,通過農桿菌介導的方法轉化水稻,篩選對水稻條紋病毒產生抗性的轉基因水稻后代,利用品種自身的抗性達到主動防治的目的. 本文首先利用pMCG161載體上的多克隆位點將RSV CP全長或部分片段的正義鏈、反義鏈、正反鏈分別連接到載體上,其中正反鏈之間由一段載體上的內含子作為間隔,

4、從而形成發(fā)夾結構.再根據(jù)農桿菌EHA105介導法轉化水稻的需要,將初步構建的載體上包含目的基因結構的片段酶切后連接到水稻轉化常用載體pCAMBIA1301,最終構建成適合農桿菌介導法轉化水稻的載體,構建了含RSV CP全長和部分基因片段的正義鏈、反義鏈和正反義干涉載體.此外,通過對pMCG161空載體和pCAMBIA1301載體的改造,構建了既可用于干涉,又能直接用于農桿菌介導的水稻轉化成一種新載體.利用農桿菌EHA105的介導將構建的

5、干涉載體轉入水稻模式品種愛知旭和推廣品種皖粳97及秀水11的成熟胚愈傷組織,利用PCR的方法對轉化得到的水稻進行目的基因檢測,初步鑒定獲得以愛知旭為受體的T0代轉基囚水稻8棵(其中轉p1301=CP載體5棵,轉p1301=HCP載體3棵),皖粳97為受體的TO代轉基因水稻1棵(轉p1301=CP載體),秀水11為受體的T0代轉基因水稻2棵(轉p1301=CP載體).對轉基因水稻再進行GUS、NOS、35S、HPT等幾種載體上存在的元件進

6、行檢測,初步判斷轉入水稻的元件基因是否發(fā)生丟失.對皖粳97轉基因水稻的后代隨機抽取樣品(T1代20棵、T2代約66棵)進行目的基因檢測和元件檢測,初步鑒定其中的70棵為陽性轉基因水稻后代. 為了保證接種壓力,首先對實驗室飼養(yǎng)的帶毒灰飛虱種群進行檢測,測得其帶毒率為93.40﹪.利用帶毒灰飛虱進行接種實驗,每株水稻接種10-12頭灰飛虱,接種7天后將灰飛虱轉移或殺死,將植株移栽大田或溫室.對獲得的愛知旭為受體的轉基因水稻(T0)及

7、其后代(T1)和皖粳97為受體的轉基因水稻(T0)及其后代(T1、T2)進行接種實驗,接種后大約55-60天進行抗病性調查.病情調查結果表明,T0代轉基因愛知旭水稻有5棵表現(xiàn)高抗,有2棵表現(xiàn)免疫.與非轉基因水稻皖粳97相比,轉基因皖粳97植株發(fā)病延遲,大部分轉基因水稻的發(fā)病癥狀明顯減輕或者未出現(xiàn)癥狀.參照抗性評價標準進行抗病性分析,對照皖粳97植株表現(xiàn)高感,T2代皖粳97為受體的轉基因水稻中的3個株系表現(xiàn)中感,7個株系表現(xiàn)中抗,5個株系

8、表現(xiàn)高抗(其中3個株系的T1代植株表現(xiàn)免疫).通過對T0、T1、T2代皖粳97轉基因植株的連續(xù)抗病性調查,可以看出T1代轉基因植株對RSV的抗性可以遺傳給T2后代.接種后發(fā)病等級為0的轉基因水稻植株中病毒CP的含量及其mRNA積累量與非轉基因水稻相比明顯較低. 文中抽取不同轉基因水稻進行外源插入結構的左右邊界分析，以及其旁側序列測定.轉基因秀水11水稻0-1具有不完整的左邊界和右邊界,通過右邊界的序列分析初步推測在0-1中外源片