利用雙T-DNA載體系統(tǒng)和RNAi培育抗水稻條紋病毒轉(zhuǎn)基因水稻.pdf

1、雙T-DNA載體系統(tǒng)是實現(xiàn)篩選完成后刪除選擇標記基因的一種簡便可行的方式。為獲得無選擇標記抗水稻條紋病毒（RSV）的轉(zhuǎn)基因水稻，本研究通過構(gòu)建RNAi的雙T-DNA植物高效表達載體，采用根癌農(nóng)桿菌（EHA105）介導的方法轉(zhuǎn)化水稻，經(jīng)潮霉素抗性篩選、PCR 檢測及Southern、Northern雜交分析，獲得了無抗生素標記的、高抗RSV水稻新種質(zhì)，為水稻抗RSV育種奠定了基礎。具體結(jié)果如下：
　　 1.以雙元載體pCAMBIA

2、1300 為基礎，加入高效表達的玉米泛素基因Ubi 啟動子；
　　 然后以pBI121中的Nos3′＋T-DNA LB 為模板，設計引物（在引物的兩端加上合適的限制性內(nèi)切酶位點，且在3′端加上T-DNA RB序列），PCR 擴增得到含有Nos 終止子＋LB＋RB的cDNA片段，進一步連接于重組載體中，獲得含有雙T-DNA的表達載體pCAMBIA1300DT。測序驗證載體構(gòu)建的準確性。繼而以RSV的SP基因為模板，PCR克隆SP基

3、因3′端400bp的cDNA片段，分別反向插入構(gòu)建的雙T-DNA的表達載體pCAMBIA1300DT中PLD基因內(nèi)含子的兩側(cè)，構(gòu)建了RNAi 植物表達載體pDTRSVSP。
　　 2.將構(gòu)建的植物表達載體pDTRSVSP 利用凍融法導入農(nóng)桿菌EHA105，轉(zhuǎn)化水稻豫粳6號及抗蟲、抗除草劑水稻新材料SK。經(jīng)潮霉素篩選、PCR 檢測，分別獲得豫粳6號轉(zhuǎn)基因植株20 株和SK 轉(zhuǎn)基因植株18 株。PCR 檢測的結(jié)果表明hpt基因和SP

4、基因的共轉(zhuǎn)化率為44.7％。
　　 3.含hpt基因和SP基因的T0 代轉(zhuǎn)基因植株自交后，獲得的T1 代轉(zhuǎn)基因株系，分子檢測表明有13.08％的植株只含有SP基因；這些植株進一步自交，在T2 代獲得了無hpt基因、而SP基因純合穩(wěn)定的豫粳6號轉(zhuǎn)基因株系6個、SK 轉(zhuǎn)基因株系5個。
　　 4.對獲得的11個僅含目的基因的T2 代純合株系進行RSV 抗性鑒定，結(jié)果顯示，有3個豫粳6號轉(zhuǎn)基因株系和2個SK 轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為高抗