利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究水稻條紋病毒與寄主水稻之間的互作.pdf

1、近年來，由水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病在各地爆發(fā)流行，已經(jīng)成為我國(guó)水稻(Oryzasativa)生產(chǎn)上的重要的病害之一，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)RSV的生物學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行了廣泛系統(tǒng)的研究，明確了水稻條紋葉枯病的地理分布、癥狀、病原性質(zhì)、血清學(xué)、致病性分化、分子變異、細(xì)胞病理學(xué)及品種抗性等，但是對(duì)于該病毒一些蛋白的功能、病毒的致病機(jī)制及寄主對(duì)病毒的抗感病作用機(jī)制等尚不清

2、楚。因此，從分子水平上研究病毒蛋白及其與寄主蛋白之間的互作關(guān)系，對(duì)于闡明上述諸多問題具有重要的意義。 RT-PCR擴(kuò)增獲得了RSV三個(gè)功能蛋白的基因CP、SP和NSvc4，分別將其構(gòu)建到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7和捕獲載體pGADT7上，獲得了重組子pGrBK-CP、pGBK-SP、pGBK-NSve4、pGAD-CP、pGAD-SP和pGAD-NSvc4。將上述重組子分別單獨(dú)轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中，在不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基

3、上檢測(cè)CP、SP和NSve4蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性和自激活活性。將重組子兩兩共轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中，于不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上檢測(cè)RSV CP、SP、NSve4三個(gè)蛋白自身之間及兩兩之間的互作情況。結(jié)果表明，RSV CP、SP、NSvc4三個(gè)蛋白對(duì)酵母菌AH109都未表現(xiàn)出毒性和自激活活性，酵母雙雜交結(jié)果顯示RSV CP蛋白自身能夠發(fā)生互作，而SP、NSve4蛋白自身未有檢測(cè)到互作現(xiàn)象的存在，CP與SP，CP與NSve4。SP與NSve

4、4蛋白之間也未有檢測(cè)到互作現(xiàn)象。 提取對(duì)RSV抗性差異顯著而遺傳背景基本一致的兩個(gè)水稻品種(品系)“武育粳3號(hào)”和“KT95-418”幼苗葉片總RNA，通過SMART技術(shù)合成了雙鏈cDNA，通過合適的酶切位點(diǎn)將cDNA片段定向插入到改造的載體NpGADT7中，構(gòu)建了兩品種(品系)水稻的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。文庫(kù)質(zhì)量鑒定結(jié)果表明：所構(gòu)建的兩個(gè)文庫(kù)庫(kù)容量均大于1.0×106 cfu，初始文庫(kù)滴度分別為1.0×1010cfu/mL和

5、5.0×1010 cfu/mL，擴(kuò)增文庫(kù)滴度為1．0×1011cfu/mL。兩文庫(kù)重組率均大于95％，“武育粳3號(hào)”文庫(kù)cDNA插入片段長(zhǎng)度集中分布在700-800 bp之間，“KT95-418”集中分布在750-1,000 bp之間。小規(guī)模測(cè)序結(jié)果表明兩文庫(kù)中全長(zhǎng)基因的比例均超過60％。 抽提純化兩種文庫(kù)質(zhì)粒，分別將其轉(zhuǎn)化到含有誘餌質(zhì)粒pGBK-CP、pGBK-SP和pGBK-NSvc4的酵母菌AH109中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布不同營(yíng)

6、養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，篩選可能與誘餌蛋白互作的陽(yáng)性克隆。PCR鑒定陽(yáng)性克隆子中cDNA插入片段的大小，將含有不同長(zhǎng)度插入片段的酵母質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DHSα中，并送交公司測(cè)序。在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，尋找同源序列。根據(jù)同源序列的注釋信息，分析所篩選的陽(yáng)性克隆菌落中cDNA插入片段的大小、序列完整性、讀碼框正確性等。結(jié)果表明，以不同的誘餌篩選不同的cDNA文庫(kù)獲得了不同種類和數(shù)量的陽(yáng)性克?。阂訰SV CP為誘餌

7、，從“武育粳3號(hào)”文庫(kù)中篩選獲得4個(gè)不同的陽(yáng)性克隆；以RSV CP為誘餌，從“KT95-418”文庫(kù)中篩選獲得2個(gè)不同的陽(yáng)性克??；以RSV SP為誘餌，從“武育粳3號(hào)”文庫(kù)中篩選獲得5個(gè)不同的陽(yáng)性克?。灰訰SV SP為誘餌，從“KT95-418”文庫(kù)中篩選獲得6個(gè)不同的陽(yáng)性克隆；以RSV NSvc4為誘餌，從“武育粳3號(hào)”文庫(kù)中篩選獲得9個(gè)不同的陽(yáng)性克?。灰訰SV NSvc4為誘餌，從“KT95-418”文庫(kù)中篩選獲得9個(gè)不同的陽(yáng)性克隆

8、。根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中陽(yáng)性克隆對(duì)應(yīng)同源基因的功能注釋，并結(jié)合已有文獻(xiàn)對(duì)該互作蛋白的研究報(bào)道，初步推測(cè)了蛋白互作在RSV致病和寄主對(duì)病毒侵染應(yīng)答過程中可能發(fā)揮的作用。 從酵母雙雜交篩選結(jié)果中挑取了3個(gè)比較有意思的克隆CW8、NB2和NB5，RT-PCR擴(kuò)增其基因全長(zhǎng)并進(jìn)行測(cè)序鑒定．結(jié)果表明，擴(kuò)增獲得了NB2和NB5全長(zhǎng)基因，而CW8擴(kuò)增產(chǎn)物較之?dāng)?shù)據(jù)庫(kù)同源序列要短．將全長(zhǎng)NB2和NB5構(gòu)建到酵母雙雜交捕獲載體PGADT7上獲得了重組子pOA

9、D-NB2和pCAD-NB5。將pGAD-m2和pCAD-NB5分別與誘餌質(zhì)粒pGBK-CP、pGBK-SP、pGBK-NSvc4共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，并涂布不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基平板，檢測(cè)NB2和NB5全長(zhǎng)基因表達(dá)產(chǎn)物與RSV CP、SP和NSvc4的互作情況。結(jié)果表明，NB2、NB5完整蛋白均能與NSvc4發(fā)生互作，而與CP、SP不具有互作關(guān)系。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白互作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，又分別以重組子p

10、GBK-CP、pGBK-SP和pGBK-NSvc4為模板，PCR擴(kuò)增獲得了融合有c-Myc標(biāo)簽的CP、SP和NSvc4基因；以pOAD-CP、pOAD-SP、pGAD-NSvc4和pGAD-NB5為模板，PCR擴(kuò)增獲得了融合有HA標(biāo)簽的CP、SP、NSvc4和NB5基因。分別將上述融合基因構(gòu)建在植物表達(dá)載體pEGAD和pKYLX71：35S2載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobaeterium tumefaciem)EHA105后，制各

11、農(nóng)桿菌注射液并注射本氏煙(Nicofiana benthamiana)，使外源蛋白在本氏煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)。提取本氏煙葉片總蛋白，以HA抗體或c-Mye抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，收集免疫混合物，SDS-PAGE電泳后，以c-Myc抗體或HA抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，確定蛋白的互作情況。檢測(cè)結(jié)果與酵母雙雜交結(jié)果一致：RSV CP蛋白自身能夠發(fā)生互作，而CP與SP，CP與NSvc4，SP與SP，SP與NSvc4，及NSvc4與NSv

12、c4蛋白之間均未有檢測(cè)到互作現(xiàn)象；NSvc4能夠與NB5發(fā)生互作，而未檢測(cè)到CP、SP與NB5之間存在互作關(guān)系。 利用熒光定量PCR(Real Time PCR)技術(shù)檢測(cè)CW8、NB5和SB12基因mRNA在健康水稻葉片和RSV侵染后的水稻葉片中的表達(dá)情況。比較mRNA表達(dá)量的差異，從而分析RSV侵染及病毒蛋白與寄主蛋白互作對(duì)其mRNA表達(dá)情況的影響。結(jié)果表明，CW8 mRNA在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達(dá)量相比表現(xiàn)

13、為下調(diào)：NB5 mRNA表達(dá)量基本不存在差異；SB12mRNA在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達(dá)量相比表現(xiàn)為上調(diào)。 除上述研究之外，本論文還研究了水稻條紋病毒CP與葉綠體Rubiseo SSU引導(dǎo)肽融合基因的構(gòu)建及其原核表達(dá)情況：PCR擴(kuò)增獲得水稻葉綠體Rubisco SSU引導(dǎo)肽基因和RSV CP基因。分別借助于pGEX-4T-1和pET-29a表達(dá)載體，通過兩種方法構(gòu)建了融合基因PR-CP和PR-S-CP。將重組子p

14、GEX-PR-CP和pET-PR-S-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌(EscheHchia cold BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果大小一致。Western-blot鑒定發(fā)現(xiàn)兩種融合基因的表達(dá)產(chǎn)物均能與RSVCP抗體特異結(jié)合，說明融合蛋白中RSVCP蛋白保持了自身的抗原活性，葉綠體Rubisco SSU引導(dǎo)肽并未影響其正確表達(dá)．可以推測(cè)兩種融合基因PR-CP和PR-S-CP在生物體內(nèi)表達(dá)時(shí)，融合蛋白中的Ru

15、bisco SSU引導(dǎo)肽和RSVCP蛋白有可能都能保持各自獨(dú)立的結(jié)構(gòu)和功能。 綜上所述，通過酵母雙雜交系統(tǒng)和免疫共沉淀技術(shù)研究了RSV三個(gè)功能蛋白CP、SP和NSvc4自身和兩兩之間的互作情況；利用酵母雙雜交系統(tǒng)從兩個(gè)水稻品種(品系)cDNA文庫(kù)中篩選了可能與CP、SP和NSvc4具有互作關(guān)系的寄主蛋白，并通過免疫共沉淀技術(shù)對(duì)其中幾個(gè)寄主蛋白與誘餌蛋白的互作情況進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證；利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)可能與病毒蛋白互作的幾種寄