水稻條紋病毒在寄主體內(nèi)的mRNA表達(dá)分析.pdf

1、本研究根據(jù)GenBank中已有的水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)基因序列，設(shè)計(jì)了RSV編碼的7個基因的特異性引物，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR方法(Real-time PCR )，建立了RSV的Real-time PCR的檢測體系。對RSV侵染后不同時間點(diǎn)的水稻懸浮細(xì)胞和不同傳毒效率的灰飛虱進(jìn)行了檢測，得到了RSV 7個基因的mRNA表達(dá)情況。 以水稻的模式種--日本睛為材料，建立了水稻懸浮細(xì)胞系，通過PEG

2、介導(dǎo)的方式將RSV接種到水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)。不同時間點(diǎn)取樣，提取總RNA，以其為模板合成RSV編碼的7個基因和內(nèi)參基因的第一鏈cDNA。應(yīng)用SYBR Green I熒光染料法進(jìn)行Real-time PCR，檢測RSV各個基因在不同時間點(diǎn)取樣樣品中的mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果表明：在RSV侵染水稻懸浮細(xì)胞后0 h、12 h、24 h、36 h、48 h和60 h均能檢測到RSV 7個基因的存在。其中RdRp基因的mRNA表達(dá)量在RSV侵染水稻懸

3、浮細(xì)胞后12 h達(dá)到高峰，其表達(dá)量為侵染初期的45.07倍，與其它6個基因的mRNA表達(dá)量的變化顯著不同。其它6個基因(NS2、NSvc2、NS3、CP、SP和NSvc4)的mRNA表達(dá)量均在RSV侵染后48 h達(dá)到表達(dá)高峰，其mRNA表達(dá)量分別是侵染初期的21.08、10.92、11.99、140.14、50.19和1.54倍。上述表明RSV侵染水稻懸浮細(xì)胞后48 h達(dá)到復(fù)制高峰。采用t-test對RSV 7個基因在水稻懸浮細(xì)胞內(nèi)病毒

4、侵染復(fù)制過程中的mRNA表達(dá)量變化的差異顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示RdRp基因mRNA表達(dá)量的變化最顯著，其t值為2.67(P=0.05～0.025)。CP基因的mRNA表達(dá)量變化最穩(wěn)定，其t值為1.35(P=0.40～0.20)。 經(jīng)過4代的雜交選育，選育了3種不同的灰飛虱群體：高效傳毒(HETP)、低效傳毒(LETP)和帶毒不傳毒灰飛虱群體(NTVP)。高效傳毒群體內(nèi)的單頭灰飛虱的傳毒率為95％，低效傳毒群體內(nèi)的單頭灰飛虱的傳

5、毒率僅為5％，帶毒不傳毒群體內(nèi)的單頭灰飛虱的傳毒率為0。說明帶毒不傳毒的灰飛虱可以通過飼毒獲得RSV病毒，但是卻不能將病毒傳給健康的水稻植株。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了灰飛虱的傳毒能力是可以通過連續(xù)的人工雜交選育而改變的。應(yīng)用Real-time PCR對RSV 7個基因在這3種灰飛虱群體內(nèi)的mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示：RSV 7個基因在高效傳毒和低效傳毒灰飛虱體內(nèi)的表達(dá)量均大于其在帶毒不傳毒灰飛虱體體內(nèi)的表達(dá)量，但是除NSvc2和NSv