水稻條紋病毒功能蛋白與水稻蛋白的互作研究.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的水稻條紋葉枯病是水稻上的一種重要病毒病，該病在我國(guó)的分布極為廣泛，給人們帶來(lái)巨大的損失。為了對(duì)該病毒的蛋白功能、致病機(jī)制及寄主對(duì)病毒的抗感病作用機(jī)制有深入的了解，我們從分子水平上研究了病毒蛋白及其與寄主蛋白之間的互作關(guān)系。本研究在蛋白篩選的基礎(chǔ)上，利用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)病毒蛋白與寄主蛋白之間的互作做進(jìn)一步的驗(yàn)證，并針對(duì)RSV編碼的功能蛋白NS2，對(duì)其互作情況進(jìn)行了研究。

2、 在構(gòu)建水稻文庫(kù)(“武育粳3號(hào)”和“KT95-418”)的基礎(chǔ)上，分別以RSV CP、SP、NSvc4為誘餌蛋白，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選出一系列與病毒蛋白存在相互作用的水稻蛋白。從篩選結(jié)果中挑取了兩個(gè)比較有意思的克隆CB18和NB17，RT-PCR擴(kuò)增其基因全長(zhǎng)，將全長(zhǎng)CB18和NB17構(gòu)建到酵母雙雜交捕獲載體pGADT7上，鑒定篩選獲得了重組子pGAD-CB18和pGAD-NB17。將pGAD-CB18和pGAD-NB17分別與誘

3、餌質(zhì)粒pGBK-CP、pGBK-SP、pGBK-NSvc4共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，并涂布不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基平板，檢測(cè)CB18和NB17全長(zhǎng)基因表達(dá)產(chǎn)物與RSVCP、SP和NSvc4的互作情況。結(jié)果表明，CB18與CP存在互作現(xiàn)象，但互作不強(qiáng)烈，與NSVc4、SP不具有互作關(guān)系；NB17與NSVc4具有互作，而與CP、SP不具有互作關(guān)系。 利用熒光定量PCR(Real Time PCR)技術(shù)檢測(cè)CB18、NB17基因mRNA在

4、RSV侵染后的水稻葉片和健康水稻葉片中的表達(dá)情況。比較mRNA表達(dá)量的差異，從而分析RSV侵染及病毒蛋白與寄主蛋白互作對(duì)其mRNA表達(dá)情況的影響。結(jié)果表明，CB18 mRNA在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達(dá)量相比表現(xiàn)為上調(diào)；NB17 mRNA在RSV侵染后的水稻中與在健康水稻中的表達(dá)量相比表現(xiàn)為下調(diào)。 借助原核表達(dá)載體PGEX-4T-1，構(gòu)建了CB18的融合蛋白原核表達(dá)重組子PGEX-CB18。轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esche

5、richia coli)BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)其表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期結(jié)果大小一致，表達(dá)的融合蛋白GST-CB18相對(duì)分子量約為37KD。進(jìn)一步制備了CB18的抗血清，Western blot結(jié)果顯示所制備的抗血清能與誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，并進(jìn)一步利用Western blot檢測(cè)了在RSV侵染后的水稻和健康水稻中CB18蛋白表達(dá)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CB18在RSV侵染后的水稻中蛋白表達(dá)量比在健康水稻中表達(dá)量

6、高。 除上述研究之外，本研究還通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得了水稻條紋病毒(RSV)功能蛋白基因NS2，將其構(gòu)建到酵母雙雜交捕獲載體pGADT7和誘餌載體pGBKT7上，通過(guò)篩選鑒定獲得了重組子pGAD-NS2、pGBK-NS2。將上述重組子分別單獨(dú)轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，檢測(cè)NS2自激活活性。將重組子分別與NSVc4、CP、SP酵母表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，