水稻條紋病毒編碼的SP蛋白功能及其與寄主因子PsbP的互作研究.pdf

1、由水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻條紋葉枯病是目前我國(guó)水稻生產(chǎn)上最具威脅性的病毒病之一。近年來(lái)該病在我國(guó)不同省市水稻產(chǎn)區(qū)多次爆發(fā)，甚至流行成災(zāi)，使水稻生產(chǎn)受到嚴(yán)重影響，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。RSV基因組RNA4的病毒鏈編碼一個(gè)病害特異蛋白(disease-specific protein，SP)。過去研究發(fā)現(xiàn)SP蛋白在病葉中的積累量與褪綠花葉癥狀的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，推測(cè)該蛋白是致病相關(guān)蛋白，但SP蛋白的

2、具體功能至今還沒有相關(guān)報(bào)道。為了弄清SP蛋白在RSV侵染及致病中的作用，本論文對(duì)SP蛋白的功能及其與寄主因子的互作機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　 利用馬鈴薯X病毒(Potato virus X)異源病毒載體表達(dá)SP基因并侵染本氏煙，與PVX空載體侵染的植株相比，SP蛋白的表達(dá)能夠顯著加重癥狀。根據(jù)在線蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://www.predictprotein.org）的分析結(jié)果，對(duì)SP基因進(jìn)行無(wú)義突變和缺失突變，并將各突變體構(gòu)

3、建到PVX載體上浸潤(rùn)本氏煙。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)SP缺失了C端52個(gè)氨基酸(muSP4)時(shí)，致病能力顯著減弱，癥狀接近于PVX空載體侵染的植株。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將SP基因分別整合入本氏煙和水稻的基因組中，并將muSP4基因也整合入本氏煙基因組中，Northern和Western印跡分析表明SP及muSP4基因能夠在這些轉(zhuǎn)基因植株中正常轉(zhuǎn)錄翻譯，但植株沒有任何異常表型。進(jìn)一步在轉(zhuǎn)基因植株上接種RSV病毒，與轉(zhuǎn)空載體植株相比，轉(zhuǎn)SP基因植株發(fā)病明顯提前

4、，癥狀加重，并且Northern blot檢測(cè)到病毒積累量也顯著增多，而RSV在轉(zhuǎn)muSP4基因植株和在轉(zhuǎn)空載體植株上的侵染效率無(wú)明顯差異。表明SP蛋白的表達(dá)提高了病毒的侵染效率，且SP的C端結(jié)構(gòu)域起關(guān)鍵作用。
　　 以RSV SP蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從水稻cDNA文庫(kù)中篩選與SP蛋白互作的水稻寄主因子。通過營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和ABA抗生素篩選，并進(jìn)一步通過回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，最終確定了OsPsbP蛋白是與SP互作的水稻寄主因子之

5、一。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)水稻、普通煙、大麥、竹子編碼的PsbP基因具有很高的氨基酸同源性?？寺”臼蠠熤械腜sbP全長(zhǎng)cDNA（NbPsbP）構(gòu)建到pGADT7載體上，并將SP各個(gè)突變體基因構(gòu)建到pGBKT7載體上，經(jīng)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SP與NbPsbP蛋白也能互作，而muSP4不能與兩種PsbP蛋白互作。通過雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)SP和PsbP蛋白能夠在煙草表皮細(xì)胞中互作，并且互作主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，而muSP4在植物體內(nèi)同樣不

6、能與PsbP蛋白互作。將SP和PsbP兩個(gè)蛋白體外表達(dá)純化，通過GST pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)兩個(gè)蛋白在體外也能互作。
　　 為了進(jìn)一步了解RSV SP與PsbP的互作機(jī)理，利用轉(zhuǎn)基因和RNAi技術(shù)獲得PsbP過表達(dá)和表達(dá)下調(diào)的水稻和本氏煙植株，通過real-time RT-PCR、Northernblot和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)PsbP確實(shí)顯著上調(diào)或者下調(diào)。觀察發(fā)現(xiàn)PsbP表達(dá)下調(diào)的植株葉片輕微發(fā)白，生長(zhǎng)遲

7、緩，而過表達(dá)植株表型正常。通過光合作用相關(guān)參數(shù)測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PsbP表達(dá)下調(diào)的本氏煙與轉(zhuǎn)SP基因本氏煙葉片中的凈光合速率、電子傳遞效率和最大光化學(xué)效率均顯著下降，說(shuō)明在這些植株中光合作用受到抑制。
　　 常溫包埋葉片并電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PsbP表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞中的葉綠體結(jié)構(gòu)紊亂，片層結(jié)構(gòu)疏松瀕臨瓦解，而在轉(zhuǎn)SP基因和感染RSV的植株細(xì)胞中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。在煙草細(xì)胞中對(duì)PsbP蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，將PsbP與GFP的融合表達(dá)載體在本氏煙

8、葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，36小時(shí)后提取原生質(zhì)體，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PsbP融合蛋白在野生型本氏煙中僅定位于葉綠體，而在轉(zhuǎn)SP基因的本氏煙中除了定位于葉綠體，還定位于細(xì)胞質(zhì)，說(shuō)明SP蛋白的存在能夠改變PsbP的亞細(xì)胞定位。進(jìn)一步通過免疫膠體金標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PsbP蛋白在各種處理的植株葉綠體中的積累量和定位情況，發(fā)現(xiàn)在PsbP表達(dá)下調(diào)的植株細(xì)胞中PsbP蛋白僅定位于葉綠體中，但是積累量是野生型本氏煙的25％左右，而在感染RSV和轉(zhuǎn)SP基因的

9、植株細(xì)胞中PsbP蛋白定位于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，并且在葉綠體中的積累量顯著下降到對(duì)照的35-60％。在轉(zhuǎn)muSP4基因的本氏煙中PsbP蛋白的定位和積累量與對(duì)照沒有顯著差異。這些結(jié)果表明，SP能夠通過與PsbP的互作改變PsbP蛋白的定位，并減少其在葉綠體中的積累量。
　　 為了了解RSV SP與PsbP互作的生物學(xué)意義，我們利用DNA1和BMV載體分別沉默本氏煙和水稻中的PsbP基因，將real-time RT-PCR證

10、實(shí)PsbP基因表達(dá)顯著下調(diào)的植株與PsbP過表達(dá)和表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)基因植株一起進(jìn)行病毒侵染效率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型本氏煙相比，RSV侵染效率在過表達(dá)PsbP的植株中明顯下降，植株發(fā)病略微推遲，癥狀較輕，且Northern印跡檢測(cè)到的病毒積累量較少;而在PsbP表達(dá)下調(diào)的植株中則剛好相反，RSV侵染效率顯著提高，植株發(fā)病提前，癥狀加重，檢測(cè)到的病毒積累量明顯高于對(duì)照。表明PsbP蛋白的積累量會(huì)影響病毒的侵染效率。
　　 上述結(jié)