小麥黃花葉病毒CP互作寄主因子篩選及品種抗性分析.pdf

1、小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）為大麥黃花葉病毒屬（Bymovirus）成員，由土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）傳播。病毒外殼蛋白是其唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的侵染過程中扮演多種角色，其攜帶著與介體和寄主的識(shí)別信息，主要功能包裝病毒粒子，參與介體傳播，病毒與寄主和介體的識(shí)別，調(diào)節(jié)RNA復(fù)制，病毒細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)和系統(tǒng)侵染，尤其是對(duì)病毒侵染寄主后癥狀的顯現(xiàn)起了決定性作用。由于小

2、麥黃花葉病毒的傳播介體抗逆性極強(qiáng)，種植抗病品種為防治此病的唯一有效方法。本文以小麥黃花葉病毒外殼蛋白（coat protein,CP）為研究對(duì)象，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體，在小麥酵母雙雜交cDNA文庫中篩選與之互作的寄主蛋白，并對(duì)276個(gè)小麥品種進(jìn)行了田間病圃抗性鑒定。以期為探索小麥黃花葉病毒與小麥互作機(jī)制提供理論支持，為小麥黃花葉病毒發(fā)生區(qū)的品種合理利用提供技術(shù)指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下：
　　（1）小麥酵母雙雜交cDNA文庫及pGB

3、K-CP誘餌載體構(gòu)建
　　本研究以小麥全株為材料，采用Trizol法提取小麥總RNA，參照FastTrack?MAG mRNA Isolation Kit說明書分離純化后獲得的mRNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，按照CloneMiner的說明書進(jìn)行初級(jí)文庫構(gòu)建。然后進(jìn)行LR反應(yīng)重組到酵母雙雜交載體pGADT7-DEST上，轉(zhuǎn)化DH10B感受態(tài)細(xì)胞，獲得酵母雙雜交cDNA文庫，涂布LB平板鑒定文庫質(zhì)量；擴(kuò)增WYMV-CP基因，連接到誘餌

4、載體pGBKT7上，并對(duì)融合誘餌載體在酵母中的毒性、自激活活性及蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。研究結(jié)果表明：構(gòu)建的cDNA文庫的滴度為5.86×106CFU/mL,庫容量為2.34×107CFU,重組率為95.8％，隨機(jī)選取24個(gè)克隆，只有一個(gè)插入片段較小，其余都大于1Kb；誘餌載體在酵母中無毒性和自激活活性，能夠表達(dá)一個(gè)60kDa大小的融合蛋白。
　?。?）與小麥黃花葉病毒CP互作的寄主因子篩選
　　中量提取文庫質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化酵母Y187

5、感受態(tài)細(xì)胞；構(gòu)建的WYMV-CP基因誘餌載體，轉(zhuǎn)化Y2H GOLD酵母感受態(tài)細(xì)胞。將含有小麥cDNA文庫的酵母Y187和含有WYMV-CP誘餌載體的Y2H GOLD進(jìn)行有性雜交，篩選與小麥黃花葉病毒CP互作的寄主因子。通過有性雜交共篩選到29個(gè)陽性克隆，通過NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)，25個(gè)克隆讀碼框正確，其中4個(gè)克隆為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）基因片段，1個(gè)克隆為苯丙

6、氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）基因片段，1個(gè)克隆為葉綠體依賴ATP的FTSH2蛋白酶（ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH2,chloroplastic）基因片段，3個(gè)克隆為TaENO-b烯醇激酶（isolate TaENO-b enolase）基因片段，其余為未知功能的小麥基因片段。
　　（3）小麥品種對(duì)小麥黃花葉病毒的抗性鑒定
　　2

7、013-2015年利用分級(jí)評(píng)價(jià)方法對(duì)276個(gè)小麥品種進(jìn)行了田間病圃抗病鑒定。三年調(diào)查結(jié)果表明，在供試小麥品種中，免疫品種占所有種植品種的比例最大，2013-2015分別占比63.77%、74.64%、66.67%；抗性品種所占比例最小，3年分別占比3.62%、2.54%、4.71%；3年中中抗品種分別占比18.12%、18.12%、25.72%；感病品種分別占比14.49%、4.71%、2.90%。其中阜麥936、淮麥18、連麥2號(hào)等1