番茄花葉病毒外殼蛋白與煙草IP-L蛋白的互作分析.pdf

1、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)是煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）的成員之一，基因組為單鏈正義RNA，大小約為6.4kb，編碼了3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白和17.6kDa的外殼蛋白(coatprotein,CP)。通過汁液機(jī)械摩擦傳播及種子帶毒傳播，番茄是其主要的寄主，對(duì)番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量造成了嚴(yán)重的影響。該病毒與寄主相互作用的機(jī)制尚不完全清楚。與外殼蛋白互作的蛋白IP-L(CP-interactin gpro

2、tein-L，IP-L)是在煙草體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的可以與ToMVCP在體內(nèi)互作的蛋白，ToMVCP同IP-L的互作與黃化癥狀表達(dá)存在怎樣的相關(guān)性？基于這一問題，我們首先要從ToMVCP同IP-L的互作機(jī)理問題入手，以兩個(gè)蛋白間的互作為切入點(diǎn)，從根本上深入研究ToMVCP同IP-L的互作意義。為了進(jìn)一步了解ToMV與寄主的互作機(jī)制，本文對(duì)ToMVCP與煙草IP-L的互作進(jìn)行了初步分析。
　　 對(duì)IP-L的研究至今為止都只局限在煙草植株的葉

3、片內(nèi)，對(duì)于煙草植株其它部位IP-L的存在性一直未見提及。此外，對(duì)于其他茄科植物而言，這種與煙草花葉病毒CP存在互作的寄主因子是否也存在？針對(duì)煙草內(nèi)IP-L的分布以及IP-L在茄科其他植物中的存在情況，我們提取煙草根、莖、葉及其他植物葉片的總RNA，用RT-PCR方法進(jìn)行了檢測(cè)和克隆分析。結(jié)果顯示，IP-L并不是特異性地只在葉部存在，在莖中甚至根部都有存在同源基因。對(duì)辣椒、茄子、番茄、馬鈴薯中的IP-L同源基因克隆分析顯示IP-L在這幾種

4、植物中同樣存在。氨基酸序列分析顯示，他們的IP-L氨基酸序列與煙草的IP-L氨基酸序列差異不大，與普通煙的氨基酸同源性分別是94.2％、94.7％、95.3％、94.9％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)上述植物中的IP-L在與ToMVCP互作的必須區(qū)域--α螺旋區(qū)未見存在差別。
　　 張朝政等人的研究確定了IP-L與ToMVCP的體外結(jié)合位點(diǎn)，但是，這些位點(diǎn)是否也是在煙草植物體中二者發(fā)生互作的必需位點(diǎn)尚且不明確。因此，我將通過對(duì)IP-L基因與CP基因

5、的突變或缺失，利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)對(duì)存在相互作用的IP-L與ToMVCP進(jìn)行進(jìn)一步的證實(shí)，研究?jī)蓚€(gè)蛋白間相互作用的必需位點(diǎn)或片段以確定互作的關(guān)鍵部位。為了進(jìn)一步確定ToMVCP與煙草IP-L在煙草體內(nèi)的互作所需要的必需位點(diǎn)，我們對(duì)IP-L進(jìn)行了兩處突變(L9A及H12G)，并且對(duì)CP進(jìn)行兩種缺失，缺失N端的106個(gè)氨基酸的CP缺失體以及缺失C端的105個(gè)氨基酸的CP缺失體。分別以IP-L突變體與缺失N端的106個(gè)氨基酸的CP缺失體及I

6、P-L突變體與缺失C端的105個(gè)氨基酸的CP缺失體為兩個(gè)目標(biāo)蛋白，構(gòu)建植物表達(dá)載體pUC-SPYCE-35S-△IP-L、pSPYNE-35S-△CP106和pSPYNE-35S-△CP105，利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)分析了其互作情況。結(jié)果表明，△IP-L突變體(L9A，H2G)雖然使IP-L同ToMVCP的結(jié)合能力變?nèi)?，但不能使這種結(jié)合能力喪失。ToMVCP的缺失體△CP106和△CP105均能在煙草體內(nèi)與IP-L互作。說明CP的C端5