黃瓜綠斑駁花葉病毒外殼蛋白與寄主煙草蛋白間的互作.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員，主要侵染葫蘆科作物，近年來在我國多次爆發(fā)流行，給人們帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對于CGMMV編碼蛋白的功能和病害的防治都有了一定的認(rèn)識，但是對于病毒和寄主間的互作尚不清楚，本文對CGMMV編碼的外殼蛋白與寄主煙草蛋白間的互作進(jìn)行了研究。
　　 本文從感染CGMMV的黃瓜葉片提取總

2、RNA，通過RT—PCR獲得目的基因CGMMV—CP，并成功克隆到pMD18—T載體上，經(jīng)序列測定驗證后，構(gòu)建成重組酵母表達(dá)載體pDB—CP。將酵母表達(dá)載體pDB—CP轉(zhuǎn)化酵母菌MaV203，以含有pDB—CP的酵母菌制備酵母感受態(tài)，采用順序轉(zhuǎn)化法篩選煙草cDNA文庫，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基，觀察酵母菌生長情況并檢測β半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明，以CP為誘餌篩選獲得14個陽性克隆，序列比對后只有一個克隆具有正確讀碼框，且與煙草

3、ribosomal protein L14(RPL14)蛋白有很高的同源性。
　　 為進(jìn)一步確定獲得的陽性克隆基因所編碼的全長蛋白是否與CP互作，將RPL14基因構(gòu)建至酵母表達(dá)載體pDEST22，與CP共轉(zhuǎn)化酵母菌MaV203，經(jīng)不同的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基的篩選和β半乳糖苷酶活性的檢測，結(jié)果表明RPL14和CP間存在互作。雙分子熒光互補實驗和免疫共沉淀實驗進(jìn)一步證實了CP和RPL14存在互作。亞細(xì)胞定位研究表明RPL14主要定位于細(xì)